骨髓間充質(zhì)干細胞移植對擴張型心肌病膠原重塑影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 探討經(jīng)外周靜脈途徑移植骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)心衰的可行性及對膠原重塑的影響。
　　 方法：
　　 1.擴張型心肌病心衰動物模型的構(gòu)建與鑒定
　　 選取體質(zhì)量為240～290g的8周齡、SPF級近交系雄性SD大鼠85只，分為2組：DCM組(n=65)、正常對照組(n=20

2、)。DCM組采用腹腔注射多柔比星(adriamycin，ADR，阿霉素)的方法(每次2.5mg/kg，1次/周，共6周，累積劑量15mg/kg)構(gòu)建DCM心衰模型；正常對照組以等容積的生理鹽水代替ADR進行腹腔注射。給藥第10周對兩組大鼠行心臟超聲檢查，觀察左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率。給藥第10周末每組大鼠任取10只處死后，行心肌組織HE、Masson病理染色、心肌膠原分析及免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、

3、Ⅲ型膠原表達。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 選取體質(zhì)量為50～70g的3周齡SPF級近交系雄性SD大鼠，收集雙側(cè)股骨、脛骨之骨髓，采用直接貼壁培養(yǎng)法體外分離、培養(yǎng)MSCs，觀察細胞形態(tài)，并對其進行純化、擴增。傳至第三代，進行免疫熒光檢測。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療擴張型心肌病
　　 將DCM組大鼠分為細胞移植組(n=13)、移植對照組(n=13)、DCM空白組(n=12)

4、。細胞移植組經(jīng)尾靜脈注射含MSCs的細胞懸液，每次細胞數(shù)量5×1O6/只，注射容積為0.5ml，共移植10次，隔日一次；移植對照組予以不含MSCs的無血清培養(yǎng)基注射，注射容積與方法同細胞移植組；DCM空白組不予任何干預(yù)。正常對照組(n=10)亦不予任何干預(yù)。四組大鼠均置于同等條件下飼養(yǎng)。于細胞移植前、末次移植后第5周及第10周分別進行心臟超聲檢查，觀察左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率。于末次移植后第10周

5、末將四組大鼠全部處死后，行心肌組織HE、Masson病理染色、心肌膠原分析及免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.擴張型心肌病心衰動物模型的構(gòu)建與鑒定
　　 經(jīng)ADR腹腔注射后，DCM組大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的紫紺、水腫、活動量減少、進食量下降等心衰表現(xiàn)。心臟超聲檢查顯示DCM組大鼠心腔擴大，室壁活動度彌漫性減弱，左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑顯著大于正常對照組[(7.1±0.3)mm

6、vs.(5.7±0.2)mm，(4.9±0.2)mm vs.(2.8±0.1)mm，P<0.05]，而左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率顯著低于正常對照組[(66.3±1.3)％vs.(88.6±0.6)％，(30.4±0.9)％vs.(51.6±0.8)％，P<0.05]。DCM組大鼠心肌組織HE染色顯示心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維正常結(jié)構(gòu)消失，細胞核深染，可見炎性細胞浸潤；心肌組織Masson染色可見大量藍染的膠原纖維，與染成紅色的心肌

7、纖維交錯排列。心肌膠原分析顯示DCM組大鼠心肌膠原容積分數(shù)為(28.24±1.28)％，明顯高于正常對照組(3.16±0.51)％，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化檢測顯示DCM組大鼠心肌細胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達；DCM組心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原比值(1.34±0.02)大于正常對照組(1.10±0.02)，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

8、>　　 剛貼壁的細胞呈三角形、紡錘形或多角形。隨著細胞傳代，貼壁細胞形態(tài)漸趨于均勻一致，且排列有序，具有一定的方向性。傳至第二代后，貼壁細胞的生長呈現(xiàn)形態(tài)單一的漩渦狀盤旋排列。通過免疫熒光法檢測第三代細胞，發(fā)現(xiàn)細胞表面CD44抗原呈陽性表達，而CD34抗原呈陰性表達，符合MSCs的細胞表面抗原特征，并結(jié)合細胞貼壁的特性及形態(tài)學(xué)觀察，可以明確為MSCs。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療擴張型心肌病
　　 細胞移植組大

9、鼠通過靜脈注射MSCs后，一般情況好轉(zhuǎn)，紫紺、水腫、活動量減少、進食量下降等心衰表現(xiàn)明顯改善。末次移植后第10周心臟超聲檢查顯示：細胞移植組左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑[(6.3±0.2)mm，(3.7±0.1)mm]明顯低于移植對照組[(7.1±0.3)mm，(5.0±0.2)mm]和DCM空白組[(7.1±0.2)mm，(5.0±0.1)mm](P<0.05)，而左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率[(79.6±1.7)％，(41.2

10、±1.7)％]明顯高于移植對照組[(65.7±0.9)％，(30.0±0.6)％]和DCM空白組[(66.1±0.9)％，(30.3±0.6)％](P<0.05)。心肌組織HE染色顯示：細胞移植組心肌纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)較移植對照組和DCM空白組明顯改善，其中可見移植細胞存活，其細胞核濃染，核漿比例較正常心肌細胞大。心肌組織Masson染色顯示：與移植對照組和DCM空白組相比，細胞移植組藍染的膠原纖維明顯減少，代之以染成紅色的心肌纖維。心肌膠

11、原分析顯示細胞移植組大鼠心肌膠原容積分數(shù)為(15.92±0.99)％，明顯低于移植對照組(29.25±1.21)％和DCM空白組(29.28±1.16)％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化檢測顯示細胞移植組大鼠心肌間質(zhì)內(nèi)增生的Ⅰ、Ⅲ型膠原較移植對照組和DCM空白組明顯減少；細胞移植組心?、?Ⅲ型膠原比值(1.23±0.02)小于移植對照組(1.35±0.02)和DCM空白組(1.35±0.02)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.

12、05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過ADR分次小劑量腹腔注射的方法(每次2.5mg/kg，1次/周，共6周，累積劑量15mg/kg)可成功建立與臨床上DCM病理及病理生理過程高度一致的經(jīng)典DCM心衰大鼠模型。
　　 2.采用直接貼壁篩選法從大鼠骨髓中成功分離出MSCs，并在體外進行MSCs的純化與擴增，通過細胞生長特性、形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光法檢測，證實所分離培養(yǎng)的細胞為MSCs。
　　 3.經(jīng)外周靜脈途