CRISPR-Cas9介導(dǎo)的家蠶抗核型多角體病毒素材創(chuàng)制研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori，B.mori）是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值的泌絲昆蟲(chóng)，以家蠶為基礎(chǔ)的蠶桑產(chǎn)業(yè)曾是我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的功勛產(chǎn)業(yè)，在當(dāng)今我國(guó)扶貧攻堅(jiān)戰(zhàn)略中仍發(fā)揮著重要作用。家蠶核型多角體病毒（B.mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見(jiàn)的危害最嚴(yán)重的一類蠶病之一，每年給我國(guó)蠶桑業(yè)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，蠶業(yè)生產(chǎn)上對(duì)BmNPV的防控仍依賴于對(duì)蠶室、蠶具、養(yǎng)蠶環(huán)境及桑葉的消毒和加強(qiáng)

2、飼養(yǎng)管理等技術(shù)措施，并不能從根本上控制病害的發(fā)生。隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)向省力化、粗放化和輕簡(jiǎn)化的方向發(fā)展，對(duì)家蠶品系的抗病毒能力的要求更高，迫切需要通過(guò)現(xiàn)代分子育種手段提高家蠶抗病毒能力。本研究利用規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas9）基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制了具有高效抗BmNPV的家蠶轉(zhuǎn)基因素材。首先，本研究建

3、立能夠編輯BmNPV的基因編輯技術(shù)平臺(tái)；接著，根據(jù)BmNPV的侵染機(jī)制系統(tǒng)篩選BmNPV復(fù)制的關(guān)鍵基因；然后，解析關(guān)鍵靶標(biāo)基因lef-11調(diào)控病毒和宿主的作用機(jī)制；最后，優(yōu)化鑒定轉(zhuǎn)基因素材的抗病毒效果，并對(duì)目前家蠶實(shí)用品系進(jìn)行遺傳改良研究。論文取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系建立及BmNPV復(fù)制關(guān)鍵靶基因篩選
　　本研究建立了家蠶介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，并鑒定了該系

4、統(tǒng)能夠有效的編輯外源基因egfp及BmNPV基因組中ie-1基因，確定了CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯系統(tǒng)能夠有效的編輯外源基因和BmNPV基因組，從而有效地抑制病毒的增殖復(fù)制，能夠應(yīng)用于家蠶抗病毒研究；根據(jù)BmNPV系統(tǒng)感染路徑和DNA復(fù)制關(guān)鍵基因，系統(tǒng)性的篩選了BmNPV侵染過(guò)程中的關(guān)鍵基因，確定lef-11基因?yàn)楣δ芪粗牟《緩?fù)制關(guān)鍵靶基因；最后，對(duì)lef-11基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯區(qū)域進(jìn)行基因編輯分析，確定了該基因是BmNPV

5、增殖復(fù)制的關(guān)鍵靶基因。高效的家蠶CRISPR/Cas9基因編輯和檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的建立，為系統(tǒng)性篩選出BmNPV增殖復(fù)制關(guān)鍵靶基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，而系統(tǒng)篩選 BmNPV復(fù)制關(guān)鍵基因則為后期家蠶抗病毒研究提供了保障。
　　2.BmNPV LEF-11多聚化功能域?qū)Σ《綝NA復(fù)制是必要的
　　LEF-11是一個(gè)13.1KDa的小分子蛋白，位于BmNPV DNA復(fù)制中心，參與病毒DNA復(fù)制。本研究對(duì)LEF-11蛋白的表達(dá)特征進(jìn)行了檢

6、測(cè)，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)LEF-11在細(xì)胞中能夠聚集到一處，非還原性SDS-PAGE結(jié)果表明LEF-11主要以四聚體的形式存在；同時(shí)，本研究建立了基于熒光共定位快速檢測(cè)蛋白互作的方法，確定了LFE-11 C端和N端都存在多聚化現(xiàn)象；進(jìn)一步通過(guò)非還原性SDS-PAGE和熒光共定位確定LEF-11 C端多聚化功能域位于aa42-61，N端多聚化功能域位于aa72-101；通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)回復(fù)缺失多聚化功能域的LEF-11，鑒定了該多聚

7、化功能域?qū)Σ《綝NA復(fù)制是必要的；同時(shí)，對(duì)LEF-11多聚化功能域疏水性氨基酸定點(diǎn)突變，確定I55、Y58&I59、I85、L88&L89對(duì)LEF-11蛋白四聚體形成是必要的；通過(guò)把定點(diǎn)突變的疏水性氨基酸回復(fù)到lef-11基因缺失型病毒中，鑒定到LEF-11疏水性氨基酸Y42、Y58&I59、I85、L88&L89對(duì)病毒DNA復(fù)制是必要的。以上結(jié)果表明LEF-11蛋白在BmNPV復(fù)制過(guò)程中是必要的，基本明確了LEF-11在病毒增殖過(guò)程中

8、的作用特征和重要性，lef-11基因可以作為家蠶抗病毒靶標(biāo)基因。
　　3.BmNPV LEF-11調(diào)控宿主細(xì)胞機(jī)制研究
　　通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)，以LEF-11蛋白為誘餌共篩選到11個(gè)LEF-11潛在相互作用的蛋白家族；經(jīng)過(guò)酵母雙雜交回轉(zhuǎn)和免疫共沉淀驗(yàn)證，確定有6個(gè)蛋白與LEF-11具有相互作用，分別是BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI、BmSamui、BmMyosin及BmROBL2；RT-PCR

9、分析互作蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果顯示除BmIMPI基因在絲腺特異表達(dá)和BmMyosin基因在表皮和頭部特異表達(dá)外，其余基因在各個(gè)組織均有表達(dá)，在BmNPV感染后，BmIMPI、BmSamui、BmMyosin、BmATADA和BmHSPD1轉(zhuǎn)錄水平均有明顯上調(diào)表達(dá)；過(guò)表達(dá)LEF-11互作蛋白后,病毒DNA復(fù)制和Western Blotting結(jié)果顯示，BmATAD3A和BmHSPD1具有明顯的促進(jìn)病毒增殖作用；敲除LEF-11互作蛋白后，流式

10、分析和Western Blotting顯示BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI和BmMyosin都具有明顯抑制病毒增殖復(fù)制的作用；綜合過(guò)表達(dá)和敲除宿主靶標(biāo)基因的結(jié)果，本研究確定BmATAD3A和BmHSPD1作為深入研究LEF-11調(diào)控宿主的關(guān)鍵因子。
　　通過(guò)抗生素篩選獲得BmATAD3A和BmHSPD1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，流式分析表明BmATAD3A和BmHSPD1具有明顯的促進(jìn)病毒增殖作用；同時(shí)基于RNAi和CRI

11、SPR/Cas9抑制或敲除BmATAD3A和BmHSPD1基因后，病毒增殖明顯受到抑制；BmATAD3A和BmHSPD1基因功能研究表明BmATAD3A和BmHSPD1均能夠和線粒體共定位，熒光共定位和免疫共沉淀分析表明它們之間也具有直接的相互作用關(guān)系；通過(guò)RNAi分析表明BmHSPD1基因?qū)Σ《緩?fù)制的影響主要是受BmATAD3A調(diào)控。結(jié)合以上結(jié)果基本確定了LEF-11調(diào)控宿主細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)模型，鑒定了LEF-11調(diào)控宿主BmATAD3A和

12、BmHSPD1的作用機(jī)制，為解析BmNPV DNA復(fù)制機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為后期家蠶抗病毒素材創(chuàng)新提供了BmATAD3A、BmHSPD1和BmMyosin等重要的宿主靶標(biāo)基因。
　　4.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的家蠶抗BmNPV素材創(chuàng)新研究
　　通過(guò)系統(tǒng)性篩選和基因功能研究，確定了lef-11基因調(diào)控病毒和宿主的機(jī)制。為應(yīng)用本研究篩選的靶標(biāo)基因用于家蠶抗病毒研究，本論文應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家蠶個(gè)體上獲得了以

13、下抗病育種研究結(jié)果：通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別獲得了表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA靶標(biāo)序列的轉(zhuǎn)基因品系，并通過(guò)雜交獲得雙陽(yáng)性品系sgRNA×Cas9；sgRNA×Cas9品系基因編輯檢測(cè)分析顯示，該品系夠有效的編輯病毒基因，感染24h后基本能夠完全編輯BmNPV基因組，一直持續(xù)到120h；抗病毒分析表明sgRNA×Cas9雜交品系能夠有效抑制BmNPV增殖，感染10天后存活率仍在90%以上，基本檢測(cè)不到BmNPV分子水平的增殖；經(jīng)濟(jì)性狀分析表明家

14、蠶基因編輯轉(zhuǎn)基因品系Cas9(-)/sgRNA(-)、Cas9(+)/sgRNA(-)、Cas9(-)/sgRNA(+)和Cas9(+)/sgRNA(+)之間的體重和繭層率沒(méi)有顯著差異。
　　CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)最大的安全隱患就是脫靶問(wèn)題，為了能夠有效的降低該系統(tǒng)的脫靶效率，本研究構(gòu)建了基于BmNPV39K啟動(dòng)子啟動(dòng)的誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并證明該系統(tǒng)能夠在較低毒力和較短時(shí)間內(nèi)快速激活；對(duì)脫靶位點(diǎn)T克隆測(cè)

15、序比較分析，BmNPV誘導(dǎo)型和穩(wěn)定表達(dá)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，能夠顯著降低基因編輯脫靶效率；同時(shí)抗病毒分析表明BmNPV誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠顯著抑制病毒增殖復(fù)制。
　　為了解決獲得轉(zhuǎn)基因品系過(guò)程繁瑣，驗(yàn)證個(gè)體基因編輯效率周期慢等問(wèn)題，本研究構(gòu)建了基于桿狀病毒表達(dá)（BEVS）包裝的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)直接注射BEVS包裝的sgRNA靶標(biāo)序列的病毒BmNPV-sgRNA到Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體上

16、，就可直接檢測(cè)對(duì)靶基因的編輯效率。基因編輯分析表明該BEVS包裝系統(tǒng)能夠有效的編輯BmNPV靶基因lef-11和BmNPV復(fù)制的宿主關(guān)鍵因子BmATAD3A及BmHSPD1，候選靶基因可以應(yīng)用于家蠶抗病毒研究。本研究結(jié)合目前中國(guó)主推家蠶實(shí)用品系，對(duì)系統(tǒng)篩選鑒定的靶標(biāo)因子進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因注射，并獲得菁松×皓月和871×871C等的抗病毒轉(zhuǎn)基因品系sgRNA×Cas9。利用以上技術(shù)和方法有望快速獲得家蠶轉(zhuǎn)基因抗病毒品系，并應(yīng)用于國(guó)內(nèi)實(shí)用品系遺傳