替代激活的單核巨噬細胞對人乳腺癌細胞株SKBR3生長侵襲的影響.pdf

1、研究背景和目的: 近年來我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，死亡率也在不斷攀升，特別是京、津、滬等發(fā)達城市以及沿海的一些省份。雖然目前對乳腺癌的治療已經(jīng)取得了明顯的進展，但遠未達到根治乳腺癌目的，經(jīng)過綜合治療后乳腺癌仍然可能復發(fā)轉(zhuǎn)移。這主要是因為，目前用于控制復發(fā)和轉(zhuǎn)移的手段主要依賴于放療和化療以及內(nèi)分泌治療，而藥物通常只是作用于增生活躍的癌細胞，對處于靜息期的癌細胞以及構(gòu)成腫瘤生長微環(huán)境的間質(zhì)成分則作用不大。而這些間質(zhì)成分則是日后腫

2、瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。 構(gòu)成腫瘤生長微環(huán)境的間質(zhì)成分包括維持腫瘤生長和作為日后遠處轉(zhuǎn)移途徑的血管；包括分泌細胞外基質(zhì)、為腫瘤的生長提供了支架的成纖維細胞；此外還有巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等炎癥細胞及這些細胞所分泌的細胞因子和化學介質(zhì)。在這些間質(zhì)成分中，巨噬細胞作為一種功能多樣化的細胞，可以通過多種途徑影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前研究認為，體內(nèi)的單核細胞主要存在兩種活化方式，一種是以細菌脂多糖(1ipopolysacc

3、haride，LPS)或γ-干擾素(interferon-γ，INF-γ)誘導的經(jīng)典激活(classicalactivation)，經(jīng)典激活的單核細胞主要以表達TNF-α為標志；一種是以Th2型細胞因子白細胞介素4(interlukin-4，IL-4)等誘導的替代激活(alternativeactivation)，替代激活的單核細胞主要以表達巨噬細胞替代激活相關(guān)化學因子-1(Altemative Macrophage Activatio

4、n-Associated CC．Chemokine-1，AMAC-1)為標志。那么這兩種激活狀態(tài)的單核細胞對腫瘤細胞到底有什么影響?與腫瘤中的巨噬細胞即腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAM的作用有無相似之處?故此我們以人外周血單核細胞為研究對象，采用LPS、IL-4在體外分別刺激單核細胞向不同的功能狀態(tài)分化，觀察不同活化狀態(tài)的單核巨噬細胞對乳腺癌細胞生長侵襲的影響。進而探討TAM在腫瘤發(fā)展中可能的作用機制。 方法: 1.人外周血單核細

5、胞的分離培養(yǎng)及誘導活化取健康成人外周血100-200ml，肝素抗凝處理后，PBS溶液等倍稀釋，采用密度梯度離心法分離得到單個核細胞，PBS洗滌，接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)在37℃、5﹪C O 2條件下孵育1 h，反復洗去懸浮的淋巴細胞，得到貼壁的單核細胞。用含10﹪胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天，根據(jù)激活介質(zhì)的不同將其分為三組：LPS組、IL-4組、培養(yǎng)基空白對照組，每組5個復孔.

6、分別加入LPS(終濃度25u個/ml)，IL-4(終濃度15ng/ml)，對照組不任何介質(zhì)，37℃、5﹪C O 2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后監(jiān)測相應分子標志物及進行下一步實驗。 2.采用RT-PCR監(jiān)測不同激活狀態(tài)的單核細胞分子標志物mRNA的表達差異分別消化收集經(jīng)不同介質(zhì)處理48-72 h的單核細胞，用TRIzol.一步法提取總RNA，以RT-PCR檢測單核巨噬細胞經(jīng)典激活分子標志物TNF-α、替代激活分子標志物AMAC-

7、1以及分子內(nèi)參照β-actin mRNA的表達，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在UVI凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察各組間表達差異，Gel pro analyser3.2軟件做半定量分析瓊脂糖凝膠電泳圖。各組細胞因子與β-actin條帶的灰度比(TNF-α/β-actin，AMAC-1/β-actin)作為各細胞因子mRNA的相對表達豐度，結(jié)果以x±s表示。 3.共培養(yǎng)觀察不同活化狀態(tài)的單核細胞對人乳腺癌細胞株SKBR3生長侵襲的影響.將SKB

8、R3細胞與經(jīng)過相關(guān)因子處理48小時后的單核細胞消化后分別接種于Transwell(濾膜孔徑0.4um)內(nèi)小室中和外室進行共培養(yǎng)，按單核細胞處理因素的不同分為LPS組、IL-4組、未激活組以及不含單核細胞的空白對照組，在共培養(yǎng)體系下共進行如下三個方面的試驗：每24小時采用MTT法監(jiān)測SKBR3細胞的生長情況，共5天，觀察不同激活的單核細胞對SKBR3生長曲線的影響；共培養(yǎng)24小時后，采用氚標記脫氧嘧啶核苷酸(3H-TdR)摻入實驗檢測不同

9、激活狀態(tài)的單核細胞對SKBR3的攝取3H-TdR的影響；采用細胞劃痕法觀察單核細胞對SKBR3乳腺癌細胞遷移能力的影響。 4.建立雞胚尿囊膜血管生成模型觀察不同活化狀態(tài)的單核細胞對乳腺癌細胞誘導新生血管生成的影響將3日齡健康江高黃雞雞胚消毒后置于超凈臺中，卵殼開窗，剪除卵膜，暴露血管豐富的尿囊膜，接種細胞于尿囊膜兩大血管之間的相對無血管區(qū)，分五組：RPMI-1640培養(yǎng)基空白對照組、單純SKBR3細胞組、未激活單核細胞+SKBR

10、3組、經(jīng)典激活單核細胞+SKBR3組、替代激活單核細胞+SKBR3組，每組10只，封閉窗口，將雞胚置于溫度37.5℃，濕度50﹪的恒溫箱中繼續(xù)孵育至10日齡，滴加10﹪的福爾馬林殺死雞胚并固定尿囊膜組織，將尿囊膜組織平鋪于載玻片上并加蓋蓋玻片后置于四倍解剖顯微鏡下觀察并拍照，選取清晰的照片記錄匯聚血管的數(shù)量，數(shù)據(jù)以x±s表示，分析三種不同活化狀態(tài)的單核巨噬細胞對腫瘤誘導新生血管形成的影響。 結(jié)果: 1.RT-PCR監(jiān)測不

11、同激活狀態(tài)的單核細胞分子標志物mRNA的表達情況LPS激活的單核細胞明顯高表達TNF-α，低表達AMAC-1；IL-4激活的單核細胞則高表達AMAC-1，低表達TNF-α；而未分化的單核細胞則兩種細胞因子均有低表達。將瓊脂糖凝膠電泳圖中各組TNF-α，AMAC-1條帶平均灰度值與β-actin平均灰度值比較進行半定量分析，結(jié)果顯示：經(jīng)典激活的單核細胞其TNF-α的表達均明顯高于替代激活的單核細胞及培養(yǎng)基對照組(P<0.05)；替代激活的

12、單核細胞其表達的AMAC-1也明顯的高于其他兩組，統(tǒng)計學檢驗均存在差異(P<0.05)。 2.不同激活狀態(tài)的單核巨噬細胞對人乳腺癌細胞株SKBR3生長、代謝、遷移的影響通過將不同活化狀態(tài)的單核巨噬細胞同乳腺癌細胞SKBR3共培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)LPS經(jīng)典激活的單核細胞呈現(xiàn)出明顯抑瘤效應，3天后曲線明顯低于其它3組(P<0.05)，隨時間的推移愈加明顯；IL-4替代激活的單核細胞則在第5天開始呈現(xiàn)出明顯促腫瘤效應高于單純培養(yǎng)劑對照組與經(jīng)

13、典激活組(P<0.05)。與未激活組無名顯差別。未激活組在共培養(yǎng)的過程中也呈現(xiàn)出促腫瘤生長的趨勢，明顯高于經(jīng)典激活組，但與單純培養(yǎng)基組對照組之間但未達到統(tǒng)計學意義的差異在代謝實驗中，各組SKBR3對3H-TdR的攝取自30分鐘開始逐漸增強，2小時后漸趨平穩(wěn)。各組中以替代激活組的SKBR3攝取最強，其余個組水平依次為未激活組、對照組、經(jīng)典激活組。替代激活的單核細胞對3H-TdR的攝取，2h顯著高于對照組(P=0.017)；30min、2h

14、顯著高于經(jīng)典激活組(P=0.001；P=0.0003)：各時點雖然也高于未激活組，但缺乏統(tǒng)計學意義。而經(jīng)典激活組SKBR3在30分鐘時的攝取率則明顯低于未激活組(P=0.014)，2h，4h也低于未激活組，但未達到統(tǒng)計學意義(P=0.07，P=0.08)。以及2h低于對照組(P=0.01)，其余各時點雖然也低于對照組，但是缺乏統(tǒng)計學差異。效應指數(shù)分析顯示，替代激活單核細胞在各時間點上表現(xiàn)出的均為正效應(>1)，而經(jīng)典激活的單核細胞則均為

15、負性效應(<1)。未激活的單核細胞其作用類似于替代激活的單核細胞。 在細胞遷移實驗中，替代激活以及未激活的單核細胞在共培養(yǎng)時能夠明顯增強乳腺癌細胞的遷移力，經(jīng)典激活的單核細胞則可以抑制單核細胞的遷移。 通過實驗我們發(fā)現(xiàn)不同激活狀態(tài)的單核細胞對于乳腺癌細胞動力學的影響是不同的，這種影響可以通過非細胞接觸的方式來實現(xiàn)，反過來乳腺癌細胞也可以通過細胞問的介質(zhì)誘導單核細胞向替代激活的方向分化。 3.不同激活狀態(tài)的單核巨噬

16、細胞對乳腺癌細胞株SKBR3誘導腫瘤血管生成的影響在不同激活的單核巨噬細胞存在的情況下，各組乳腺癌細胞誘導生成的腫瘤新生血管以接種部位為中心，呈匯聚生長。經(jīng)4倍光學顯微鏡下對新生的匯聚血管進行計數(shù)量化處理，以x±s表示。以各組平均新生血管的數(shù)量按從多到少的順序依次為：IL-4激活的單核細胞(57±14)、未激活組的單核細胞(32±8)、LPS激活的單核細胞(20±6)、單純癌細胞組(14±6)。替代激活的單核細胞組對腫瘤細胞新生血管誘導

17、生成的能力明顯高于其他各組，統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異(P<0.05)，而空白培養(yǎng)基對照組無匯聚血管的形成。 結(jié)論: 單核細胞可以被不同的細胞因子誘導向不同的活化方向分化；不同活化的單核細胞各自表達不同的分子標志物，經(jīng)典激活的單核細胞表達TNF-α，替代激活的單核細胞表達AMAC-1；在體外共培養(yǎng)的情況下替代激活的單核細胞可以促進腫瘤細胞的生長、代謝及遷移能力，而經(jīng)典激活的單核細胞則可以抑制腫瘤生長、代謝以及遷移。腫瘤細胞還