中藥單體靛玉紅抗LPS誘導的小鼠乳腺炎作用及機制研究.pdf

1、是奶牛常見病和多發(fā)病，是奶牛場危害大、投入多、難防治的疾病，正制約著我國乃至全球奶牛業(yè)的發(fā)展。絕大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺組織引起，迄今分離鑒定可導致奶牛發(fā)生乳腺炎的病原微生物達130多種，其中金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌占80％以上。盡管世界各國學者已對奶牛乳腺炎防治開展了近100余年的不懈研究，至今仍未提出一個可有效防治奶牛乳腺炎的方法?？股丿煼ㄒ恢弊鳛榉乐文膛Ｈ橄傺椎氖走x方法，伴隨其長期大量使用甚至濫用，病原耐藥性

2、乃至多重耐藥性愈發(fā)普遍，逐漸成為制約乳腺炎防治的瓶頸。食源性的動物病原甚至可借助相關食物鏈和耐藥質粒將耐藥性傳遞給人類，給人類疾病防治帶來前所未有的挑戰(zhàn)和困擾。中草藥作為純天然草藥，含多種復雜有效的生物活性成分，具有作用廣泛、不會或者難產(chǎn)生耐藥性、低毒、無或低殘留等優(yōu)勢，兼具藥物和營養(yǎng)劑的雙重功效，日益受到國內外專家學者的青睞。靛玉紅是從中藥青黛中分離出的吲哚類化合物，是青黛、大青葉、板藍根等中藥發(fā)揮效應的重要成分之一，具有抗腫瘤、抑菌

3、消炎、神經(jīng)保護、抗病毒和抗寄生蟲等方面作用，具有抗生素無法比擬的優(yōu)勢，且在防治奶牛乳腺炎、實現(xiàn)綠色養(yǎng)殖和生產(chǎn)無藥物殘留動物制品上具有非常好的潛力。因此我們提出了靛玉紅具有抗乳腺炎作用的科學設想。
　　本課題從分子、細胞和機體三個不同層次研究靛玉紅對LPS誘導的小鼠乳腺炎的防治作用并初步闡明其作用機制，為靛玉紅防控奶牛乳腺炎奠定理論及實踐基礎。主要研究結果如下:
　　1.小鼠乳腺上皮細胞的提取及鑒定
　　妊娠15-20天

4、小鼠乳腺組織采用胰蛋白酶和膠原酶混合消化法提取小鼠乳腺上皮細胞(MMECs)，提取的MMECs呈圓形、橢圓或橄欖狀生長，在鋪板的12小時基本貼壁，48小時長滿T75細胞瓶，長滿細胞瓶后呈鋪路石狀、鵝卵石狀緊密生長。免疫熒光檢測到MMECs細胞質中標記上角蛋白-18的單一明亮的綠色熒光信號，且細胞生長情況良好，純度較好。
　　2.靛玉紅和LPS試驗濃度的確定
　　使用不同脂多糖誘導MMECs，24h后收集樣品，qRT-PCR檢

5、測IL-1β、IL-6和 TNF-α等促炎因子mRNA表達水平，確定脂多糖誘導MMECs產(chǎn)生炎癥反應的最佳濃度。結果顯示，隨著LPS誘導濃度的升高，三種炎性因子的表達水平都不斷上升，在終濃度為1μg/mL時均顯著升高(p＜0.001)，并在濃度為0.8-1μg/mL時比1-2μg/mL表達水平上升趨勢明顯，因此后續(xù)試驗均選擇終濃度為1μg/mL的LPS為誘導濃度。MTT試驗檢測1-1000nM靛玉紅對MMECs活性的影響。結果證明，低濃

6、度的靛玉紅(1-250nM)對MMECs活性幾乎沒有影響，并且與LPS和靛玉紅誘導順序關系不大;250nM以上濃度靛玉紅對MMECs存在明顯的毒性作用。另用qRT-PCR檢測證明25nM以上濃度靛玉紅對IL-1β、IL-6和TNF-α具有明顯抑制作用(p＜0.001)。因此后期試驗選擇25、50和100nM三個濃度靛玉紅孵育MMECs，研究靛玉紅對MMECs炎癥的防治效果，對于動物試驗則相應提高1000倍作為試驗濃度。
　　3.靛

7、玉紅治療LPS誘導MMECs炎癥和小鼠乳腺炎作用及機制研究
　　純化后的MMECs培養(yǎng)至細胞培養(yǎng)板80％左右，使用LPS誘導MMECs產(chǎn)生炎癥作用，1h后使用靛玉紅共孵育24h。ELISA和qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。試驗表明，相對于LPS組，靛玉紅組中三個促炎因子表達水平都隨靛玉紅濃度的上升不斷下降，并在100nM處顯著降低(p＜0.001)。
　　Western bolt和qRT-PCR

8、檢測靛玉紅對COX-2活性的影響。試驗表明，靛玉紅可以劑量依賴性地抑制LPS誘導引起的COX-2活性的增加。從而證明靛玉紅可以抑制LPS誘導MMECs的炎癥反應。
　　產(chǎn)后5-7d昆明鼠，乳腺灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型，對照組乳腺灌注PBS，并在1h和12h分別腹腔注射PBS、0.1％DMSO和靛玉紅觀察其對小鼠乳腺炎的影響。乳腺組織大體組織及病理學觀察，對照組小鼠乳腺沒有觀察到病理變化;LPS組小鼠乳腺相對于對照組，出現(xiàn)水腫、

9、潮紅、變性甚至局部壞死、大量乳汁蓄積，乳腺腺泡壁增厚、大量的中性粒細胞浸潤等變化，綜合評分較對照組顯著升高(p＜0.001);靛玉紅可以改善LPS誘導小鼠乳腺的炎癥癥狀，伴隨靛玉紅使用劑量增加效果更明顯，評分不斷下降。
　　ELISA檢測靛玉紅對小鼠乳腺組織和血清中MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平的影響。結果證明靛玉紅可以劑量依賴性的抑制LPS誘導乳腺炎小鼠中MPO活性和三種促炎因子的表達，對小鼠乳腺炎具有很好的治

10、療效果。靛玉紅抑制脂多糖誘導小鼠乳腺炎的機制是什么，是否與脂多糖引起炎癥作用的通路存在相關性呢？
　　我們首先檢測了靛玉紅對TLR4信號通路的影響。試驗證明靛玉紅可以劑量依賴性抑制TLR4的表達，發(fā)揮對LPS誘導的MMECs炎癥和小鼠乳腺炎的治療作用。
　　靛玉紅抑制LPS誘導的NF-κB信號通路的激活，發(fā)揮對LPS誘導MMECs炎癥和小鼠乳腺炎的治療作用。靛玉紅可以劑量依賴性抑制LPS誘導引起的P50，P65和IκBα的m

11、RNA的表達水平和P65及IκBα磷酸化水平，發(fā)揮對LPS誘導MMECs炎癥和小鼠乳腺炎的治療作用
　　靛玉紅抑制LPS誘導的MAPK信號通路的激活，發(fā)揮對LPS誘導MMECs炎癥和小鼠乳腺炎的治療作用。25、50和100nM靛玉紅不影響非磷酸化ERK，JNK和P38蛋白水平，但劑量依賴性抑制LPS誘導的P38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平。在mRNA表達水平上，靛玉紅可抑制LPS誘導引起的P38、ERK和JNK表達水平的上升。

12、從而證明靛玉紅通過抑制MAPK信號通路的激活，發(fā)揮對LPS誘導的MMECs炎癥的治療作用。
　　4.靛玉紅對脂多糖誘導小鼠乳腺炎保護性作用及機制研究
　　已證明靛玉紅具有治療小鼠乳腺炎的作用，接著驗證靛玉紅是否對小鼠乳腺炎具有保護作用并闡明其機制。首先，小鼠乳腺組織大體組織觀察和病理切片結果證明，靛玉紅同樣具有改善LPS誘導小鼠乳腺炎的作用。綜合評分顯示，LPS組評分大約是對照組分數(shù)的6倍，顯著升高(p＜0.001);靛玉紅

13、組的評分隨著靛玉紅劑量的增加不斷下降。
　　ELISA檢測小鼠乳腺組織和血清中MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，靛玉紅可以抑制小鼠乳腺組織和血清中LPS誘導的MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，都呈現(xiàn)劑量依賴性抑制作用，證明靛玉紅具有保護LPS誘導小鼠乳腺炎的作用。那么，其保護機制是否與其治療作用一致呢？
　　接下來使用LPS誘導MMECs炎癥反應靛玉紅對小鼠乳腺炎的保護性機制研究。首先使用ELIS

14、A和qRT-PCR檢測LPS誘導MMECs中IL-1β、IL-6和TNF-α促炎因子的表達情況，證明了靛玉紅可以劑量依賴性抑制三種促炎因子的表達，并在LPS加入后約3小時開始抑制，在9小時將促炎因子抑制于穩(wěn)定水平。在COX-2檢測中，靛玉紅可以劑量依賴性抑制COX-2蛋白和mRNA的表達水平，靛玉紅可在LPS誘導后15min開始抑制COX-2蛋白表達，60min左右將其抑制在穩(wěn)定范圍;3小時左右抑制mRNA水平的上升，9小時左右?guī)缀醴€(wěn)定

15、了COX-2的變化。證明靛玉紅可以抑制促炎因子和相關的炎性介質的表達，具有調控LPS誘導MMECs產(chǎn)生的炎癥反應。
　　使用western blot和qRT-PCR檢測TLR4的表達情況，試驗證明，25、50和100nM靛玉紅可以有效抑制LPS誘導MMECs炎癥反應，并且在100nM時可以有效抑制TLR4蛋白和mRNA表達(p＜0.001)。使用100nM靛玉紅預保護MMECs再用LPS誘導，結果顯示靛玉紅在15min開始抑制TL

16、R4蛋白表達，2小時開始抑制mRNA表達，并在60min將TLR4蛋白水平穩(wěn)定在正常范圍，9小時左右抑制TLR4的mRNA水平在一個相對穩(wěn)定的水平上。
　　對于NF-κB，靛玉紅可以抑制MMECs中P-P65和P-Iκ Bα蛋白水平，并且與靛玉紅劑量存在依賴性;100nM靛玉紅保護細胞后，可以在LPS誘導MMECs后15min開始抑制兩者磷酸化水平，60min基本沒有磷酸化。
　　MAPK信號通路的檢測中，同樣證明靛玉紅在使

17、用劑量為25、50和100nM可以劑量依賴性抑制信號通路中P38、ERK和JNK的蛋白磷酸化，但是抑制時間上有差異，靛玉紅分別在LPS誘導15min、30min和45min開始抑制P38、ERK和JNK的磷酸化，但是在60min左右基本將磷酸化水平控制在一定范圍內。
　　5.靛玉紅對脂多糖引起小鼠乳腺上皮細胞凋亡的研究
　　在靛玉紅對MMECs凋亡影響中，首先使用羅丹明和DAPI對MMECs進行染色觀察細胞形態(tài)變化。結果顯示

18、，靛玉紅可以改善LPS誘導MMECs體積變小、變圓和細胞核縮小等凋亡現(xiàn)象，并且與劑量存在依賴性，靛玉紅和LPS對MMECs誘導順序對凋亡影響不明顯。
　　在對凋亡相關基因研究上，靛玉紅可以抑制LPS誘導MMECs中Bcl-2、Bcl-xL抗凋亡基因蛋白水平和/或mRNA水平的升高，抑制Bax、Bak、Caspase-3和Caspase-8等促凋亡基因蛋白和/或mRNA水平的表達，具有抑制MMECs凋亡發(fā)揮對MMECs炎癥抑制作用。