抗肺癌中藥單體的篩選及水飛薊素抑癌機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)數(shù)個(gè)大中城市中，肺癌的發(fā)病率、死亡率均已占男性惡性腫瘤的首位，女性惡性腫瘤的第二位。盡管手術(shù)、聯(lián)合化療及放療在肺癌的治療中起到了積極的作用，但因缺乏有效的早期診斷方法，70-80％的患者在確診時(shí)已失去早期根治性切除的時(shí)機(jī)。手術(shù)及放化療復(fù)發(fā)率高、易出現(xiàn)耐藥，故患者的5年生存率長(zhǎng)期停留在20-30％左右。
　　中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在腫瘤的治療方面有其獨(dú)特的理論。中醫(yī)藥治療

2、肺癌的有關(guān)資料表明：中醫(yī)藥不僅可以延長(zhǎng)肺癌患者的生存期，而且能提高他們的生存質(zhì)量。中藥配合放療、化療比單純使用放療、化療的療效更好。中藥既可增加化療藥及放射線的敏感性、又有放射防護(hù)作用，可減輕化療放療的副作用，起到抑瘤增效作用或放射增敏作用。
　　天然中藥以其療效廣泛、確切、毒性低，受到國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注。本課題我們?nèi)《喾N中藥提取物或單體，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，篩選出能夠以較低濃度（微克/毫升水平）抑制肺癌生長(zhǎng)或增殖的藥物。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、，選擇作用效果最明顯的中藥提取物或單體，研究其抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，以及對(duì)肺癌細(xì)胞化療敏感性的影響。這些研究將為治療肺癌新型藥物的研制開(kāi)發(fā)提供新思路，為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥進(jìn)一步用于腫瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?；诖?，本課題從以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　1、抗肺癌中藥單體的篩選：我們通過(guò)光學(xué)顯微鏡初步篩選了25種中藥單體或粗提產(chǎn)物中能有效抑制肺癌細(xì)胞增殖的藥物，發(fā)現(xiàn)可能有抑制腫瘤作用的(鏡下觀察有明顯細(xì)胞形態(tài)改變

4、的，如細(xì)胞皺縮，破碎，漂浮等)有12種，姜黃素、水飛薊素、大黃素、茶多酚、松多酚、大豆異黃酮、葛根異黃酮、染料木素、生姜提取物、鬼臼素、貫葉連翹提取物、桫欏子提取物等。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)其中4種純度較高（＞80％）且抑制腫瘤細(xì)胞增殖明顯的藥物，姜黃素、大黃素、水飛薊素、大豆異黃酮，進(jìn)一步采用MTT試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)肺癌細(xì)胞系的抑制效果，結(jié)果顯示：SM對(duì)幾種細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用；大黃素對(duì)Anip973和A549細(xì)胞有作用，但對(duì)NCI-H292和

5、PLA-801細(xì)胞作用較弱；姜黃素對(duì)A549和NCI-H292細(xì)胞有作用，但對(duì)Anip973和PLA-801細(xì)胞作用較弱；大豆異黃酮對(duì)Anip973和PLA-801細(xì)胞有作用，但對(duì)A549和NCI-H292細(xì)胞作用較弱。這些結(jié)果表明藥物對(duì)于不同的細(xì)胞作用并不完全一樣，造成這一現(xiàn)象的機(jī)理有待于更深入的研究。
　　2、水飛薊素誘導(dǎo)高轉(zhuǎn)移表型肺癌細(xì)胞系（Anip973）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究：本實(shí)驗(yàn)以肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973細(xì)胞為研究對(duì)

6、象，探討分別給予不同劑量和不同時(shí)間點(diǎn)的水飛薊素處理后的肺癌細(xì)胞的凋亡情況，通過(guò)形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞儀我們觀察到水飛薊素可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。在凋亡發(fā)生過(guò)程中，半胱天冬酶(caspase)家族和Bcl-2家族發(fā)揮重要作用。進(jìn)而通過(guò)免疫印記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SM作用于人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973細(xì)胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，而凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明水飛薊素的促凋亡機(jī)制與降低Bcl

7、-2/Bax的比例有關(guān)。
　　3、水飛薊素通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性：我們通過(guò)MTT法檢測(cè)到水飛薊素可以逆轉(zhuǎn)肺癌A549/DDP細(xì)胞的耐藥性，并呈時(shí)間依賴(lài)性；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示水飛薊素和順鉑聯(lián)用可以引起A549/DDP細(xì)胞凋亡或死亡，并呈時(shí)間依賴(lài)性。為了進(jìn)一步探討水飛薊素誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們采用Westernblot方法，應(yīng)用針對(duì)MAPK家族成員JNK、ERK、p38磷酸

8、化形式及非磷酸化形式的特異性抗體，檢測(cè)了SM作用后以上激酶的表達(dá)水平及活化程度的改變。在不同濃度藥物作用24hr后，這幾種激酶的表達(dá)水平都沒(méi)有明顯的改變，而它們磷酸化的程度與加入DMSO的陰性對(duì)照組相比則有顯著的改變。其中ERK的磷酸化受到明顯的抑制，而JNK、p38MAPK的磷酸化水平有一定的增加。
　　4、水飛薊素對(duì)肺癌細(xì)胞Anip973裸鼠體內(nèi)成瘤、增殖、凋亡以及血管形成的影響：本研究將Anip973細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，

9、建立人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。建立模型后，給其腹腔注射SM結(jié)果顯示，與未處理組的裸鼠相比，注射水飛薊素的裸鼠腫瘤形成時(shí)間延遲，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，腫瘤體積及瘤重均明顯減小。各組腫瘤標(biāo)本HE染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞異形性明顯，細(xì)胞大小不一，形狀各異，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)致密。未處理組腫瘤標(biāo)本凋亡細(xì)胞少見(jiàn)，而水飛薊素組腫瘤標(biāo)本提示凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、固縮、胞膜出泡、染色質(zhì)濃集、核深染。
　　綜上所述，我們認(rèn)為水飛薊素具有通過(guò)調(diào)節(jié)半胱天