乙肝病毒X蛋白調(diào)節(jié)microRNAs促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和遷移的研究.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染是肝細(xì)胞肝癌(hepatocelluarcarcinoma,HCC)發(fā)病的重要原因之一。乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein，HBx)是乙肝病毒x基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有反式激活作用，可通過多種機(jī)制導(dǎo)致HCC的發(fā)生，但其致癌的分子機(jī)制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度在19-24個(gè)核苷酸（nt)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。近

2、年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，可作為癌基因或抑癌基因促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生。為了進(jìn)一步闡明HBx致癌的分子機(jī)制，本論文從以下三個(gè)方面進(jìn)行了深入研究。
　　 第一部分：micrRNA-520b在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長作用中的研究
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，HBx與survivin協(xié)同可下調(diào)mieroRNA-520b(miR-520b)的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，本文應(yīng)用報(bào)告基因方法，在穩(wěn)定表達(dá)HB

3、x和survivin的L-O2細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-520b的啟動子活性受到抑制，且與SP-1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。然后，利用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法發(fā)現(xiàn)，miR-520b在11例臨床肝癌標(biāo)本中和4個(gè)肝癌細(xì)胞系(HepG2，H7402，MHCC-97L，MHCC-97H)中均呈低表達(dá)。應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)、EdU增殖實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-520b可以在體外抑制肝癌HepG2/H7402細(xì)胞的增殖。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，c

4、yclin DI和MEKK2是miR-520b的兩個(gè)潛在的靶基因。利用報(bào)告基因和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-520b可以直接靶向cyelin D1和MEKK2的3UTR區(qū)域，并抑制其翻譯。EdU增殖實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，cyclin D1和MEKK2具有促進(jìn)肝癌HepG2/H7402細(xì)胞增殖的作用。此外，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-520b在體內(nèi)具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長的作用。上述結(jié)果表明，miR-520b可以通過靶向

5、cyclin D1和MEKK2發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長的作用，提示miR-520b可能是一個(gè)抑癌的miRNA。miR-520b在肝癌的診斷和治療中具有應(yīng)用價(jià)值。
　　 第二部分：microRNA-29a在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移作用中的研究
　　 本研究利用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)， microRNA-29a(miR-29a)在p21-HBx轉(zhuǎn)基因鼠肝組織、穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系HepG2/H7402和整合HBV全基因組的H

6、epG2.2.15細(xì)胞中均呈上調(diào)表達(dá)。應(yīng)用RNA干擾沉默HBx mRNA，結(jié)果顯示miR-29a的表示水平與HBx有關(guān)。此外，miR-29a在具有高轉(zhuǎn)移傾向的肝癌細(xì)胞系MHCC-97H中也上調(diào)表達(dá)，提示miR-29a的功能與肝癌細(xì)胞的遷移能力有關(guān)。應(yīng)用細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Boyden's chamber實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肝癌HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a，可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力，而miR-29a抑制劑可以廢除HBx對肝癌HepG2細(xì)

7、胞遷移的促進(jìn)作用。利用生物信息學(xué)方法顯示，PTEN是miR-29a的潛在靶基因。報(bào)告基因檢測結(jié)果表明，miR-29a可以直接靶向PTEN的3uTR區(qū)域。RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌HepG2和MHCC-97L細(xì)胞中miR-29a可以顯著抑制PTENrnRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步證明PTEN是miR-29a直接的靶基因。為了進(jìn)一步探討PTEN是否參與miR-29a對細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用，我們在過表達(dá)miR-29a的肝癌He

8、pG2細(xì)胞中過表達(dá)PTEN，發(fā)現(xiàn)PTEN可明顯阻斷miR-29a的促遷移作用。Akt是已報(bào)道的PTEN下游的靶分子，為了驗(yàn)證miR-29a對PTEN的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步檢測了miR-29a對Akt磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示，miR-29a可顯著增強(qiáng)Akt的磷酸化水平，為證明miR-29a靶向PTEN發(fā)揮功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第三部分：MEKK2在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖作用中的研究
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用基因芯片檢

9、測HBx致癌過程中的基因表達(dá)譜變化，結(jié)果顯示MEKK2呈上調(diào)表達(dá)，提示MEKK2在HBx致癌過程中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步豐富HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用及其分子機(jī)制，本文探討了MEKK2是否參與HBx的促肝癌細(xì)胞增殖作用。應(yīng)用RT-PCR和免疫印跡檢測，結(jié)果證實(shí)在肝癌HepG2/H7402細(xì)胞中HBx可以在mRNA和蛋白兩個(gè)水平上調(diào)MEKK2的表達(dá)。報(bào)告基因結(jié)果顯示，在肝癌HepG2/H7402細(xì)胞中HBx可以上調(diào)MEKK2的啟動子活性，

10、顯示HBx可以在轉(zhuǎn)錄水平激活MEKK2的表達(dá)。此外，報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在HepG2.2.15細(xì)胞中MEKK2的啟動予活證明顯增強(qiáng)。AP-1和JNK是MEKK2的兩個(gè)下游效應(yīng)因子，為了進(jìn)一步驗(yàn)證HBx對MEKK2的調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用RNA干擾沉默HBx或MEKK2后，結(jié)果顯示AP-1和JNK的激活受到抑制，為HBx上調(diào)MEKK2的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。EdU增殖實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的肝癌HepG-X細(xì)

11、胞和HepG2.2.15細(xì)胞中干擾MEKK2的表達(dá)后，可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，提示MEKK2參與了HBx對肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡結(jié)果顯示，HBx和MEKK2在11例臨床肝癌標(biāo)本中均呈高表達(dá)，提示HBx與MEKK2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。組織芯片結(jié)果顯示，MEKK2在95例臨床肝癌標(biāo)本中的陽性率為85.3％，揭示MEKK2在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。
　　 綜上所述，本研究為揭示miRNAs在HBx致