乙肝病毒X蛋白調(diào)節(jié)microRNAs促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和遷移的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是肝細(xì)胞肝癌(hepatocelluarcarcinoma,HCC)發(fā)病的重要原因之一。乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein,HBx)是乙肝病毒x基因的表達(dá)產(chǎn)物,具有反式激活作用,可通過多種機(jī)制導(dǎo)致HCC的發(fā)生,但其致癌的分子機(jī)制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度在19-24個核苷酸(nt)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。近

2、年來研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,可作為癌基因或抑癌基因促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生。為了進(jìn)一步闡明HBx致癌的分子機(jī)制,本論文從以下三個方面進(jìn)行了深入研究。
   第一部分:micrRNA-520b在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長作用中的研究
   本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),HBx與survivin協(xié)同可下調(diào)mieroRNA-520b(miR-520b)的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上,本文應(yīng)用報告基因方法,在穩(wěn)定表達(dá)HB

3、x和survivin的L-O2細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-520b的啟動子活性受到抑制,且與SP-1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。然后,利用實時定量PCR(qRT-PCR)方法發(fā)現(xiàn),miR-520b在11例臨床肝癌標(biāo)本中和4個肝癌細(xì)胞系(HepG2,H7402,MHCC-97L,MHCC-97H)中均呈低表達(dá)。應(yīng)用克隆形成實驗、EdU增殖實驗和MTT實驗檢測結(jié)果顯示,miR-520b可以在體外抑制肝癌HepG2/H7402細(xì)胞的增殖。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),c

4、yclin DI和MEKK2是miR-520b的兩個潛在的靶基因。利用報告基因和免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn),miR-520b可以直接靶向cyelin D1和MEKK2的3UTR區(qū)域,并抑制其翻譯。EdU增殖實驗和MTT實驗檢測結(jié)果顯示,cyclin D1和MEKK2具有促進(jìn)肝癌HepG2/H7402細(xì)胞增殖的作用。此外,裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示,miR-520b在體內(nèi)具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長的作用。上述結(jié)果表明,miR-520b可以通過靶向

5、cyclin D1和MEKK2發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長的作用,提示miR-520b可能是一個抑癌的miRNA。miR-520b在肝癌的診斷和治療中具有應(yīng)用價值。
   第二部分:microRNA-29a在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移作用中的研究
   本研究利用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn), microRNA-29a(miR-29a)在p21-HBx轉(zhuǎn)基因鼠肝組織、穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系HepG2/H7402和整合HBV全基因組的H

6、epG2.2.15細(xì)胞中均呈上調(diào)表達(dá)。應(yīng)用RNA干擾沉默HBx mRNA,結(jié)果顯示miR-29a的表示水平與HBx有關(guān)。此外,miR-29a在具有高轉(zhuǎn)移傾向的肝癌細(xì)胞系MHCC-97H中也上調(diào)表達(dá),提示miR-29a的功能與肝癌細(xì)胞的遷移能力有關(guān)。應(yīng)用細(xì)胞傷口愈合實驗和Boyden's chamber實驗發(fā)現(xiàn),在肝癌HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a,可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力,而miR-29a抑制劑可以廢除HBx對肝癌HepG2細(xì)

7、胞遷移的促進(jìn)作用。利用生物信息學(xué)方法顯示,PTEN是miR-29a的潛在靶基因。報告基因檢測結(jié)果表明,miR-29a可以直接靶向PTEN的3uTR區(qū)域。RT-PCR和免疫印跡實驗結(jié)果顯示,在肝癌HepG2和MHCC-97L細(xì)胞中miR-29a可以顯著抑制PTENrnRNA和蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)一步證明PTEN是miR-29a直接的靶基因。為了進(jìn)一步探討PTEN是否參與miR-29a對細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用,我們在過表達(dá)miR-29a的肝癌He

8、pG2細(xì)胞中過表達(dá)PTEN,發(fā)現(xiàn)PTEN可明顯阻斷miR-29a的促遷移作用。Akt是已報道的PTEN下游的靶分子,為了驗證miR-29a對PTEN的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步檢測了miR-29a對Akt磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示,miR-29a可顯著增強(qiáng)Akt的磷酸化水平,為證明miR-29a靶向PTEN發(fā)揮功能提供了新的實驗依據(jù)。
   第三部分:MEKK2在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖作用中的研究
   本實驗室前期應(yīng)用基因芯片檢

9、測HBx致癌過程中的基因表達(dá)譜變化,結(jié)果顯示MEKK2呈上調(diào)表達(dá),提示MEKK2在HBx致癌過程中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步豐富HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用及其分子機(jī)制,本文探討了MEKK2是否參與HBx的促肝癌細(xì)胞增殖作用。應(yīng)用RT-PCR和免疫印跡檢測,結(jié)果證實在肝癌HepG2/H7402細(xì)胞中HBx可以在mRNA和蛋白兩個水平上調(diào)MEKK2的表達(dá)。報告基因結(jié)果顯示,在肝癌HepG2/H7402細(xì)胞中HBx可以上調(diào)MEKK2的啟動子活性,

10、顯示HBx可以在轉(zhuǎn)錄水平激活MEKK2的表達(dá)。此外,報告基因檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,在HepG2.2.15細(xì)胞中MEKK2的啟動予活證明顯增強(qiáng)。AP-1和JNK是MEKK2的兩個下游效應(yīng)因子,為了進(jìn)一步驗證HBx對MEKK2的調(diào)節(jié)作用,應(yīng)用RNA干擾沉默HBx或MEKK2后,結(jié)果顯示AP-1和JNK的激活受到抑制,為HBx上調(diào)MEKK2的作用提供了實驗依據(jù)。EdU增殖實驗和MTT實驗檢測結(jié)果顯示,在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的肝癌HepG-X細(xì)

11、胞和HepG2.2.15細(xì)胞中干擾MEKK2的表達(dá)后,可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖,提示MEKK2參與了HBx對肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。實時定量PCR和免疫印跡結(jié)果顯示,HBx和MEKK2在11例臨床肝癌標(biāo)本中均呈高表達(dá),提示HBx與MEKK2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。組織芯片結(jié)果顯示,MEKK2在95例臨床肝癌標(biāo)本中的陽性率為85.3%,揭示MEKK2在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。
   綜上所述,本研究為揭示miRNAs在HBx致

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