低氧預(yù)處理以及環(huán)孢霉素A減少缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、第一部分　低氧預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的保護作用及凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的影響　　采用密度梯度離心法分離獲取80克SD骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，以密度梯度離心和貼壁篩選法純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。取傳代后第三代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)鑒定，進(jìn)入實驗。培養(yǎng)后的三代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分為6組： 一組：正常的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 二組：缺氧/復(fù)氧組； 三組：0.5uM環(huán)孢霉素+缺氧/復(fù)氧； 四組：低氧預(yù)處理10

2、分鐘+缺氧/復(fù)氧； 五組：低氧預(yù)處理20分鐘+缺氧/復(fù)氧； 六組：低氧預(yù)處理30分鐘+缺氧/復(fù)氧。 采用TNNEL檢測各組的凋亡指數(shù)，并且應(yīng)用MTT法檢測各組之間的細(xì)胞活力以證實低氧預(yù)處理是否對缺氧/復(fù)氧損傷是否有保護作用。以熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位、Western—blotting方法觀察各組線粒體膜電位細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶-1/2、Akt、缺氧誘導(dǎo)因子1-α(hypoxia-inducible factor 1，

3、HIF-1α)，血管內(nèi)皮生長因子(the vascular endothelial growth。factor，VEGF)和Bcl-2等蛋白的變化情況，以闡明低氧預(yù)處理的作用機制。 結(jié)果： 1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定：體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，流式細(xì)胞學(xué)檢測骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜表面CD分子表達(dá)情況。細(xì)胞膜CD分子的表達(dá)率：CD90-99.4％；CD44—86.5％；CD45—4.47％，這符合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

4、的特征。 2.低氧預(yù)處理預(yù)防缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞活力： 在正常的培養(yǎng)條件下，大約3％的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是TUNEL-陽性的細(xì)胞核，與以前報道的一致。與正常條件培養(yǎng)的干細(xì)胞相比，經(jīng)6小時的缺氧和12小時復(fù)氧之后缺氧/復(fù)氧明顯增加TUNEL-陽性的細(xì)胞，凋亡率為48.2±3.1％，與正常細(xì)胞組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 3.低氧預(yù)處理保護缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的線粒體膜電位的衰減：

5、 正常的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞顯示紅色熒光，提示線粒體膜電位正常，而經(jīng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)之后顯示綠色熒光增多，提示膜電位衰減。低氧預(yù)處理和環(huán)孢霉素組綠色熒光明顯減少，這提示低氧預(yù)處理和環(huán)孢霉素對線粒體膜電位衰減有保護作用。 4.低氧預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的Bcl-2和BAX表達(dá)的影響： 當(dāng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧的環(huán)境中時，線粒體Bcl-2蛋白表達(dá)增加2.3±0.18倍，與正常骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。然而

6、，低氧預(yù)處理能夠更加明顯增加Bcl-2表達(dá)，高于缺氧/復(fù)氧組，低氧預(yù)處理10分鐘組為正常細(xì)胞的3.3±0.11倍，低氧預(yù)處理20分鐘組為正常細(xì)胞的3.4±0.23倍，低氧預(yù)處理30分鐘組為正常細(xì)胞的3.8±0.11倍，與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。0.5uM CsA也可以增加線粒體部分Bcl-2蛋白表達(dá)，為正常細(xì)胞的2.68±0.18倍，與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(JD<0.05)。 5.低氧預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧

7、誘導(dǎo)的ERK-1/2的影響： 當(dāng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后磷酸化ERK減少，為正常細(xì)胞的0.44±0.17倍，與正常細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)差異(JID<0.05)．然而這種作用可以被低氧預(yù)處理所逆轉(zhuǎn)，經(jīng)過低氧預(yù)處理后磷酸化ERK增加，低氧預(yù)處理10分鐘組為正常細(xì)胞的0.80±0.16倍，低氧預(yù)處理20分鐘組為正常細(xì)胞的0.91±0.03倍，低氧預(yù)處理30分鐘組為正常細(xì)胞的1.04±0.04倍，與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<

8、0.05) 6.低氧預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的的Akt影響： 當(dāng)缺氧/復(fù)氧組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞磷酸化Akt表達(dá)減少，為正常細(xì)胞的0.39±0.14倍，與正常細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。然而這種作用可以被低氧預(yù)處理所逆轉(zhuǎn)，并且低氧預(yù)處理可以時間依賴性的升高，低氧預(yù)處理10分鐘組為正常細(xì)胞的0.43±0.13倍，低氧預(yù)處理20分鐘組為正常細(xì)胞的0.47±0.12倍，低氧預(yù)處理30分鐘組為正常細(xì)胞的0.73±0.014倍，

9、與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 7.低氧預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的HIF1-α和VEGF的影響： 經(jīng)過在6小時缺氧和12小時后，HIF1-α在缺氧/復(fù)氧組和低氧預(yù)處理組沒有明顯的變化。然而，VEGF的表達(dá)在缺氧/復(fù)氧組要比正常細(xì)胞組增加1.89±0.15倍，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。同時，低氧預(yù)處理組VEGF也明顯增加，并且明顯高于缺氧/復(fù)氧組，低氧預(yù)處理10分鐘組為正常細(xì)胞的2.37±0.12倍，低

10、氧預(yù)處理20分鐘組為正常細(xì)胞的2.40±0.10倍，低氧預(yù)處理30分鐘組為正常細(xì)胞的2.44±0.11倍，與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 第二部分　環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的保護作用及凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的影響　　采用密度梯度離心法分離獲取80克SD骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，以密度梯度離心和貼壁篩選法純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。取傳代后第三代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)鑒定，進(jìn)入實驗。培養(yǎng)后的三代骨髓間質(zhì)干細(xì)

11、胞細(xì)胞分為6組： 一組：正常的骨髓問質(zhì)干細(xì)胞； 二組：缺氧/復(fù)氧組； 三組：0.5uM環(huán)孢霉素A+缺氧/復(fù)氧； 四組：5uM環(huán)孢霉素A+缺氧/復(fù)氧。采用TNNEL檢測各組的凋亡指數(shù)，并且應(yīng)用MTT法檢測各組之間的細(xì)胞活力以證實環(huán)孢霉素A是否對缺氧/復(fù)氧損傷是否有保護作用。以熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位、Western-blotting方法觀察各組細(xì)胞色素C、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶-1/2、Bad、Bcl-2和bax

12、表達(dá)的變化情況，以明確低氧預(yù)處理的作用機制。 結(jié)果： 1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定：體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，流式細(xì)胞學(xué)檢測骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜表面CD分子表達(dá)情況。細(xì)胞膜CD分子的表達(dá)率：CD90-99.4％；CD44-86.5％；CD45-4.47％，這符合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的特征。 2.環(huán)孢霉素A預(yù)防缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞活力： 在正常的培養(yǎng)條件下，大約3％的骨髓基質(zhì)干

13、細(xì)胞是TUNEL-陽性的細(xì)胞核。與正常條件培養(yǎng)的干細(xì)胞相比，經(jīng)6小時的缺氧和12小時復(fù)氧之后缺氧/復(fù)氧明顯增加TUNEL-陽性的細(xì)胞，凋亡率為48.2±3.1％，與正常細(xì)胞組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 三、環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的線粒體膜電位的影響： 正常的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞顯示紅色熒光，提示線粒體膜電位正常，而經(jīng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)之后顯示綠色熒光增多，提示膜電位衰減。環(huán)孢霉素A組綠色熒光明顯減少，這提示環(huán)孢霉

14、素A對線粒體膜電位衰減有保護作用。 四、環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)位的影響： 當(dāng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧的條件下，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞色素C從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，是正常細(xì)胞的1.4±0.04倍，與正常細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。0.5-5uM環(huán)孢霉素A可以減少缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C釋放(P<0.05)，同時，總的細(xì)胞色素C表達(dá)無論是缺氧/復(fù)氧組還是環(huán)孢霉素A都沒有明顯變化(P>0.05)。

15、 五、環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的Bcl-2和BAX表達(dá)的影響： 當(dāng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧的環(huán)境中時，總Bcl-2蛋白表達(dá)增加4.5±1.3倍，與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞正常相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 六、環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的ERK-1/2的影響當(dāng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后磷酸化ERK減少，與正常細(xì)胞比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。然而這種作用可以被壞孢霉素A所逆轉(zhuǎn)，經(jīng)過5uM環(huán)孢霉素A預(yù)孵育

16、后磷酸化ERK1/2減少，5 uM環(huán)孢霉素A組與缺氧/復(fù)氧組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而0.5 uM壞孢霉素A組與缺氧/復(fù)氧組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。環(huán)孢霉素A不影響ERK1/2表達(dá)。 七、環(huán)孢霉素A對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的的Bad和磷酸化Bad影響在缺氧/復(fù)氧組磷酸化的Bad明顯減少，與正常細(xì)胞組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。環(huán)孢霉素A可以預(yù)防缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的磷酸化Bad減少，0.5 uM環(huán)孢霉素A為正常細(xì)胞的0.