缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低氧環(huán)境下功能的影響.pdf

1、缺血性心臟病是人類死亡的主要病因之一。急性嚴(yán)重的心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，壞死的心肌細(xì)胞不可再生，而被纖維組織所代替，出現(xiàn)心肌重塑、心功能下降，逐步惡化的心功能促使惡性心律失常、心臟驟停等嚴(yán)重心臟事件發(fā)生，最終導(dǎo)致死亡。因此，人們一直在找尋一方法挽救壞死或?yàn)l臨壞死的心肌。盡管急診再灌注治療能夠降低急性心?；颊叩脑缙谒劳雎什⒏纳祁A(yù)后，但仍無(wú)法逆轉(zhuǎn)心梗后心肌重塑而致的心功能不全。通過(guò)細(xì)胞移植技術(shù)將供體干細(xì)胞植入受損的心肌組織中，生長(zhǎng)并重建心

2、肌以代替纖維組織，同時(shí)誘導(dǎo)血管新生，改善心臟功能，為治療急性心肌梗死提供了一種全新的策略[1]。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一類干細(xì)胞類型，具有自我更新和多向分化潛能，已證實(shí)這類細(xì)胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細(xì)胞分化[2～11]。它取材方便、容易分化、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)[12-14]，無(wú)免疫原性，無(wú)倫理

3、問(wèn)題。越來(lái)越多的證據(jù)支持成人干細(xì)胞具有多向分化能力而適于心肌、血管的再生治療[15]，MSC是目前應(yīng)用于細(xì)胞移植治療的較理想的種子細(xì)胞[16，17]。已有研究證明心肌梗死后應(yīng)用MSC移植治療能夠改善心功能，減緩心肌重塑，促進(jìn)血管新生，而且MSC在移植區(qū)域的存活可使其所攜帶的基因穩(wěn)定表達(dá)，但由于在梗死心肌局部的氧氣或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供需失調(diào)，MSC的生存能力不足，制約了MSC在心肌梗死部位的存活和分化。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypox

4、ia induced factor-1，hif-1)是一種參與機(jī)體缺氧調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、改善供給等提高細(xì)胞和組織的耐缺氧能力。Hif-1由hif-1a和hif-1β兩個(gè)亞基組成，其中hif-1a是它的活性部分。已有研究證明hif-1a能夠改善缺氧心肌的功能，但未能證明轉(zhuǎn)染hif-1a的缺血心肌組織能夠穩(wěn)定表達(dá)hif-1a，因此hif-1a的作用可能轉(zhuǎn)瞬即逝。
　　 Hif-1a對(duì)細(xì)胞低氧時(shí)凋亡具有雙向調(diào)節(jié)的特點(diǎn)

5、。我們假設(shè)hif-1a能夠減少M(fèi)SC低氧時(shí)的凋亡，改善MSC缺氧時(shí)的生存力和細(xì)胞功能，而以MSC作為載體hif-1a在缺氧環(huán)境可持續(xù)高表達(dá)，那末轉(zhuǎn)染hif-1a的MSC則能夠顯著減緩心梗后心肌重塑、縮小心肌壞死面積。本研究擬觀察hif-1a對(duì)MSC在低氧時(shí)生存和功能的影響，以此作為基礎(chǔ)在體實(shí)驗(yàn)中對(duì)比分析hif-1a對(duì)MSC移植治療心梗效果的影響和機(jī)制。本研究的創(chuàng)新在于將聯(lián)合應(yīng)用hif-1a和MSC治療大鼠急性心肌梗死作為研究目標(biāo)，而目前

6、與此相關(guān)的研究目前還很少，我們希望本研究能為急性心梗的治療的探索做出貢獻(xiàn)。
　　 目的：
　　 通過(guò)對(duì)比應(yīng)用不同方法、不同血清濃度的培養(yǎng)基在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的效果，篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳分離培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的血清濃度。觀察低氧時(shí)hif-1a轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的MSC增殖分化的差異，探討Hif-1a對(duì)MSC在低氧環(huán)境中的影響。比較不同情況下(hif-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植后、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC移植后、MSC移

7、植后、未行細(xì)胞移植)急性心梗大鼠梗死心肌面積、缺血區(qū)毛細(xì)血管的新生及心肌重塑的變化，探討hif-1a對(duì)MSC移植治療大鼠急性心梗效果的影響，并淺析其機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 Wistar大鼠處死后分別應(yīng)用直接貼壁法、密度梯度離心法分離大鼠MSC，常規(guī)換液及少量換液方法行細(xì)胞培養(yǎng)，并比較在10％、11%、15%不同血清濃度時(shí)大鼠MSC的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量和群體倍增時(shí)間。P3代細(xì)胞行細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞分化功能鑒定。應(yīng)

8、用脂質(zhì)體作為載體將HIF-1a轉(zhuǎn)染至P3代MSC，熒光觀察GFP表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用G418對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞行穩(wěn)定篩選，應(yīng)用有限稀釋法對(duì)篩選后細(xì)胞行單克隆培養(yǎng)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC和未轉(zhuǎn)染的MSC置于低氧環(huán)境下，比較三種細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)等方面的差異，并檢測(cè)HIF-1amRNA、VEGFmRNA、HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)。應(yīng)用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支方法制作大鼠心肌梗死模型，將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、單純心梗組、心梗+MS

9、C移植組及心梗+HIF-1a轉(zhuǎn)染MSC移植組，每組取8只大鼠用于結(jié)果觀察，細(xì)胞移植組于心梗模型成功即刻在梗死心肌及其周圍行細(xì)胞移植。術(shù)后4周將大鼠處死后分離心臟，稱重，測(cè)量左室心腔大小，左室心肌厚度，應(yīng)用HE染色的方法觀察心肌結(jié)構(gòu)、梗死心肌局部及周圍毛細(xì)血管新生，免疫熒光染色觀察移植細(xì)胞在心肌局部的分布，westernblot方法檢測(cè)心肌HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 分別應(yīng)用直接貼壁法+常規(guī)

10、換液、直接貼壁法+少量換液、密度梯度離心法+常規(guī)換液、密度梯度離心法+少量換液的方法分離培養(yǎng)大鼠MSC，細(xì)胞的平均倍增時(shí)間分別為36.0±0.9小時(shí)、23.5±1.1小時(shí)、49.8±1.2小時(shí)、48.0±0.8小時(shí)。MSC在分離后3-10天形成集落，呈漩渦狀生長(zhǎng)。血清濃度篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)11%為MSC生長(zhǎng)的最適血清濃度。免疫組化方法細(xì)胞表面抗原鑒定CD45(-)，CD90(+)；流式細(xì)胞儀分析MSC細(xì)胞表面抗原表達(dá)CD450.38%，CD

11、9098.4%。P3代MSC可以成功向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體法可以成功將pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP轉(zhuǎn)染至MSC，轉(zhuǎn)染效率21%。經(jīng)G418篩選、應(yīng)用有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC單細(xì)胞克隆。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC仍具有向脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力，且在低氧條件下(CoCl2模擬缺氧)pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC較空質(zhì)粒(pcDNA3.0-eGFP)轉(zhuǎn)染的MSC和未轉(zhuǎn)染

12、的MSC凋亡率下降(P<0.05)，增殖旺盛(P<0.05)，并能高表達(dá)hif-1a mRNA及蛋白(P<0.05)、VEGF mRNA及蛋白(P<0.05)。
　　 大鼠急性心梗模型手術(shù)成功率為37%。HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組移植細(xì)胞成活率顯著高于其他各組(P<0.05)。術(shù)后4周時(shí)HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組大鼠的心臟重量、左心室腔大小顯著低于其他3組(P<0.05)，左室心肌厚度顯著高于其他組(P<0.05)，梗死

13、心肌及其周圍毛細(xì)血管增生較其他組顯著增加(P<0.05)。HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組大鼠心肌顯著高表達(dá)HIF-1a蛋白(P<0.05)及VEGF蛋白(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用直接貼壁法和少量換液方法分離培養(yǎng)的MSC增殖快。11%應(yīng)為MSC生長(zhǎng)的較適血清濃度。
　　 Hif-1a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC在低氧時(shí)高表達(dá)hif-1a蛋白、hif-1a mRNA、VEGF蛋白和VEGFmRNA。Hif-1a