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文檔簡介
1、目的:
探討山藥多糖對體外培養(yǎng)的胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞毒性劑量,對缺氧/復氧性神經(jīng)細胞活性影響及抗凋亡作用、以及抗凋亡機制,為山藥多糖臨床應用于防治腦缺血/缺氧疾病提供理論基礎和實驗依據(jù),為中藥多糖的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。
方法:
1、胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞無血清培養(yǎng)。
2、胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞無血清缺氧/復氧培養(yǎng)。
3、MTT法檢測不同劑量的山藥多糖對正常和缺氧/復氧培養(yǎng)的胚鼠大腦皮層神
2、經(jīng)細胞的刺激和毒性作用。
4、實驗分組:(1)正常對照組(Con.):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在37℃、5.0%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6d;(2)陽性對照(凋亡誘導)組(Apo.):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在37℃、5.0%飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后再缺氧培養(yǎng)12h復氧培養(yǎng)24h培養(yǎng);(3)山藥多糖干預組(CYPS):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在37℃、5.0%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后,分別加入終濃度為0.025g/L(C
3、YPS1組)、0.05g/L(CYPS2組)、0.1g/L(CYPS3組)、0.25g/L(CYPS4)山藥多糖預處理4h后再缺氧培養(yǎng)12h復氧培養(yǎng)48h。
5、Annexin V-FITC/PI熒光雙染流式細胞儀測定實驗各組神經(jīng)細胞早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率。
6、Hoechst33342熒光染色觀察實驗各組神經(jīng)細胞凋亡形態(tài)變化及實驗各組的細胞凋亡率。
7、流式羅丹明-123(Rh-123)熒光染色檢
4、測實驗各組神經(jīng)細胞內(nèi)線粒體損傷情況。
8、核DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗各組神經(jīng)細胞凋亡晚期核DNA降解情況。
9、RT-PCR半定量法檢測實驗各組神經(jīng)細胞內(nèi)Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的相對表達。
10、免疫細胞化學染色檢測細胞NSE及GFAP陽性表達率,鑒定培養(yǎng)的神經(jīng)細胞,以及實驗各組神經(jīng)細胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的陽性表達率。
結果:
1、
5、體外培養(yǎng)6d的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞經(jīng)抗NSE、GFAP抗體免疫細胞化學染色顯示,細胞NSE陽性率為(93.7±0.56)%,而GFAP陽性表達率僅為(8.78±0.55)%。
2、MTT法測定體外常氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn),山藥多糖在0.05g/L~0.5g/L的濃度范圍內(nèi)神經(jīng)細胞生長活性較對照組顯著升高(P<0.05),在1.0g/L~4.0g/L的濃度范圍內(nèi)對神經(jīng)細胞活性無顯著影響(P>0.05),而當山藥
6、多糖濃度為8.0g/L時對神經(jīng)細胞生長有明顯地抑制作用(P<0.05)。
3、MTT法測定經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn),各實驗組較常氧培養(yǎng)正常對照組神經(jīng)細胞生長活性明顯降低(P<0.05),但山藥多糖濃度在0.05g/L~0.1g/L時顯著地抑制缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷(P<0.05),而在0.025 g/L和0.25g/L~1.0g/L之間對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷也有一定的保護作用
7、,2.0 g/L加重缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷并與凋亡陽性組相同。
4、Hochest33342熒光染色法分析經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn),山藥多糖在0.025 g/L~0.25g/L各組凋亡率分別為(32.08±1.64)%、(26.74±0.45)%、(22.32±1.81)%、(28.54±0.79)%,均較凋亡陽性組(37.61±2.87)%明顯下降(P<0.05),且較正常對照組(
8、6.48±0.55)%凋亡率顯著升高(P<0.05)。
5、流式Annexin V-FITC/PI熒光雙染法分析經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn),正常培養(yǎng)組、凋亡陽性組和CYPS1~CYPS4組早期凋亡率分別為(2.46±0.58)%、(51.50±2.44)%、(36.67±2.53)%、(26.17±3.80)%、(13.87±2.67)%、(43.63±0.75)%。CYPS1~CYPS4組
9、早期凋亡率較正常培養(yǎng)組明顯升高(P<0.05),但較凋亡誘導組神經(jīng)細胞凋亡率顯著下降(P<0.05),且在0.05g/L~0.1g/L濃度范圍內(nèi)神經(jīng)細胞早期凋亡率隨山藥多糖濃度的增加而下降。而山藥多糖對神經(jīng)細胞晚期凋亡率和壞死率則無顯著影響。
6、流式羅丹明123(Rhodamine123)熒光染色法分析經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神細胞顯示,缺氧的神經(jīng)細胞線粒體損傷在正常培養(yǎng)組、凋亡陽性組和CYPS1~
10、 CYPS4組平均熒光強度分別為232.33±17.62,34.30±13.00,54.87±8.95,159.33±4.51,180.33±13.43,45.90±3.53;且山藥多糖濃度在0.05g/L~0.1g/L之間能顯著抑制缺氧誘導的神經(jīng)細胞線粒體損傷(P<0.05),證明山藥多糖能夠一定程度的減少缺氧對神經(jīng)細胞線粒體損傷,并具有劑量依賴效應。
7、瓊脂糖DNA凝膠電泳分析經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大
11、腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn),山藥多糖凋亡誘導組可以觀察到明顯的凋亡條帶,而正常對照組及山藥多糖0.1g/L組未見明顯凋亡條帶,其它組條帶有所減弱。
8、RT-PCR分析經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn)缺氧的神經(jīng)細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達在正常對照組、凋亡陽性組、CYPS1~ CYPS4組表現(xiàn)出一定的變化,其Caspase-3 mRNA的相對表達率分別為0.62±0.02,1
12、.24±0.03,1.17±0.10,0.87±0.10,0.78±0.05,0.97±0.03; Bax mRNA的相對表達率分別為0.28±0.04,0.70±0.02,0.65±0.07,0.52±0.06,0.38±0.06,0.52±0.11;Bcl-2 mRNA的相對表達率分別為0.88±0.13,0.49±0.09,0.45±0.06,0.67±0.01,0.71±0.05,0.63±0.11。山藥多糖在0.1 g/L~0
13、.25g/L之間能顯著下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達,在0.05g/L~0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Bax mRNA的表達,在0.05g/L~0.1g/L范圍內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(P<0.05)。
9、免疫細胞化學染色檢測經(jīng)山藥多糖預處理后缺氧/復氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn)缺氧的神經(jīng)細胞凋亡蛋白Bax和Caspase-3與抗凋亡蛋白Bcl-2表達在正常對照組、凋亡陽性組和CYPS1~ CY
14、PS4組表現(xiàn)出一定變化,其Caspase-3蛋白陽性細胞率分別為37.03%±0.38%、58.89%±0.45%、55.65%±0.24%、53.54%±0.79%,45.76%±0.53%,52.42%±1.06%; Bax蛋白陽性細胞率分別為53.32%±0.77%,65.08%±1.02%,61.70%±2.12%,57.34%±2.53%,53.74%±1.72%,58.38%±1.11%; Bcl-2蛋白陽性細胞率分別為59
15、.36%±2.23%,37.83%±1.08%,43.54%±0.93%,46.82%±0.63%,52.82%±1.33%,45.88%±1.38%。山藥多糖在0.025g/L~0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達,在0.1g/L~0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Bax蛋白表達,在0.05g/L~0.25g/L范圍內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(P<0.05)。
結論:
1、SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)
16、細胞無血清培養(yǎng)神經(jīng)元含量達(93.7±0.56)%。
2、山藥多糖在0.05g/L~0.5g/L的濃度范圍內(nèi)能顯著提高神經(jīng)細胞生長活性;在0.05g/L~0.1g/L的濃度內(nèi)能顯著地抑制缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷。
3、山藥多糖在0.025g/L~0.25g/L的范圍內(nèi)能顯著抑制神經(jīng)細胞早期凋亡凋亡;在0.025g/L~0.25g/L的濃度內(nèi)能顯著抑制缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞線粒體損傷。
4、山藥多糖在0
17、.1 g/L~0.25g/L的濃度內(nèi)能顯著下調(diào)缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞Caspase-3 mRNA的表達,在0.05g/L~0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Bax mRNA的表達,在0.05g/L~0.1 g/L濃度內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達;在0.025g/L~0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達,在0.1g/L~0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Bax蛋白表達,在0.05g/L~0.25g/L濃度內(nèi)能顯著上
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