山藥多糖抗缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的胚鼠大腦皮層原代神經(jīng)細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、目的:
　　探討山藥多糖對(duì)體外培養(yǎng)的胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞毒性劑量，對(duì)缺氧/復(fù)氧性神經(jīng)細(xì)胞活性影響及抗凋亡作用、以及抗凋亡機(jī)制，為山藥多糖臨床應(yīng)用于防治腦缺血/缺氧疾病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥多糖的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞無血清培養(yǎng)。
　　2、胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞無血清缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)。
　　3、MTT法檢測(cè)不同劑量的山藥多糖對(duì)正常和缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的胚鼠大腦皮層神

2、經(jīng)細(xì)胞的刺激和毒性作用。
　　4、實(shí)驗(yàn)分組:(1)正常對(duì)照組(Con.):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在37℃、5.0％飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6d;(2)陽性對(duì)照（凋亡誘導(dǎo)）組(Apo.):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在37℃、5.0％飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后再缺氧培養(yǎng)12h復(fù)氧培養(yǎng)24h培養(yǎng);(3)山藥多糖干預(yù)組(CYPS):原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在37℃、5.0％飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后，分別加入終濃度為0.025g/L（C

3、YPS1組）、0.05g/L（CYPS2組）、0.1g/L（CYPS3組）、0.25g/L(CYPS4)山藥多糖預(yù)處理4h后再缺氧培養(yǎng)12h復(fù)氧培養(yǎng)48h。
　　5、Annexin V-FITC/PI熒光雙染流式細(xì)胞儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率。
　　6、Hoechst33342熒光染色觀察實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡形態(tài)變化及實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞凋亡率。
　　7、流式羅丹明-123(Rh-123)熒光染色檢

4、測(cè)實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷情況。
　　8、核DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡晚期核DNA降解情況。
　　9、RT-PCR半定量法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)。
　　10、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞NSE及GFAP陽性表達(dá)率，鑒定培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，以及實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率。
　　結(jié)果:
　　1、

5、體外培養(yǎng)6d的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)抗NSE、GFAP抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，細(xì)胞NSE陽性率為(93.7±0.56)％，而GFAP陽性表達(dá)率僅為(8.78±0.55)％。
　　2、MTT法測(cè)定體外常氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，山藥多糖在0.05g/L～0.5g/L的濃度范圍內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)活性較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，在1.0g/L～4.0g/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性無顯著影響(P＞0.05)，而當(dāng)山藥

6、多糖濃度為8.0g/L時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯地抑制作用(P＜0.05）。
　　3、MTT法測(cè)定經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組較常氧培養(yǎng)正常對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)活性明顯降低(P＜0.05)，但山藥多糖濃度在0.05g/L～0.1g/L時(shí)顯著地抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷(P＜0.05)，而在0.025 g/L和0.25g/L～1.0g/L之間對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷也有一定的保護(hù)作用

7、，2.0 g/L加重缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷并與凋亡陽性組相同。
　　4、Hochest33342熒光染色法分析經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，山藥多糖在0.025 g/L～0.25g/L各組凋亡率分別為(32.08±1.64)％、(26.74±0.45)％、(22.32±1.81)％、(28.54±0.79)％，均較凋亡陽性組(37.61±2.87)％明顯下降（P＜0.05），且較正常對(duì)照組(

8、6.48±0.55)％凋亡率顯著升高(P＜0.05)。
　　5、流式Annexin V-FITC/PI熒光雙染法分析經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)組、凋亡陽性組和CYPS1～CYPS4組早期凋亡率分別為（2.46±0.58）％、(51.50±2.44)％、（36.67±2.53）％、（26.17±3.80）％、（13.87±2.67）％、（43.63±0.75）％。CYPS1～CYPS4組

9、早期凋亡率較正常培養(yǎng)組明顯升高(P＜0.05)，但較凋亡誘導(dǎo)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.05)，且在0.05g/L～0.1g/L濃度范圍內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率隨山藥多糖濃度的增加而下降。而山藥多糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞晚期凋亡率和壞死率則無顯著影響。
　　6、流式羅丹明123(Rhodamine123)熒光染色法分析經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神細(xì)胞顯示，缺氧的神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷在正常培養(yǎng)組、凋亡陽性組和CYPS1～

10、 CYPS4組平均熒光強(qiáng)度分別為232.33±17.62，34.30±13.00,54.87±8.95,159.33±4.51,180.33±13.43,45.90±3.53;且山藥多糖濃度在0.05g/L～0.1g/L之間能顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷(P＜0.05)，證明山藥多糖能夠一定程度的減少缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷，并具有劑量依賴效應(yīng)。
　　7、瓊脂糖DNA凝膠電泳分析經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大

11、腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，山藥多糖凋亡誘導(dǎo)組可以觀察到明顯的凋亡條帶，而正常對(duì)照組及山藥多糖0.1g/L組未見明顯凋亡條帶，其它組條帶有所減弱。
　　8、RT-PCR分析經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)在正常對(duì)照組、凋亡陽性組、CYPS1～ CYPS4組表現(xiàn)出一定的變化，其Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)率分別為0.62±0.02，1

12、.24±0.03，1.17±0.10，0.87±0.10，0.78±0.05，0.97±0.03; Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)率分別為0.28±0.04，0.70±0.02，0.65±0.07，0.52±0.06，0.38±0.06，0.52±0.11;Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)率分別為0.88±0.13，0.49±0.09，0.45±0.06，0.67±0.01，0.71±0.05，0.63±0.11。山藥多糖在0.1 g/L～0

13、.25g/L之間能顯著下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達(dá)，在0.05g/L～0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，在0.05g/L～0.1g/L范圍內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　9、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)經(jīng)山藥多糖預(yù)處理后缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)的SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Caspase-3與抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)在正常對(duì)照組、凋亡陽性組和CYPS1～ CY

14、PS4組表現(xiàn)出一定變化，其Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞率分別為37.03％±0.38％、58.89％±0.45％、55.65％±0.24％、53.54％±0.79％，45.76％±0.53％，52.42％±1.06％; Bax蛋白陽性細(xì)胞率分別為53.32％±0.77％，65.08％±1.02％，61.70％±2.12％，57.34％±2.53％，53.74％±1.72％，58.38％±1.11％; Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞率分別為59

15、.36％±2.23％，37.83％±1.08％,43.54％±0.93％,46.82％±0.63％,52.82％±1.33％,45.88％±1.38％。山藥多糖在0.025g/L～0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，在0.1g/L～0.25g/L范圍內(nèi)能顯著下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，在0.05g/L～0.25g/L范圍內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、SD胚鼠大腦皮層神經(jīng)

16、細(xì)胞無血清培養(yǎng)神經(jīng)元含量達(dá)(93.7±0.56)％。
　　2、山藥多糖在0.05g/L～0.5g/L的濃度范圍內(nèi)能顯著提高神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)活性;在0.05g/L～0.1g/L的濃度內(nèi)能顯著地抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。
　　3、山藥多糖在0.025g/L～0.25g/L的范圍內(nèi)能顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡凋亡;在0.025g/L～0.25g/L的濃度內(nèi)能顯著抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷。
　　4、山藥多糖在0

17、.1 g/L～0.25g/L的濃度內(nèi)能顯著下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)，在0.05g/L～0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，在0.05g/L～0.1 g/L濃度內(nèi)能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá);在0.025g/L～0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，在0.1g/L～0.25g/L濃度內(nèi)能顯著下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，在0.05g/L～0.25g/L濃度內(nèi)能顯著上