中國HIV-1流行株對廣譜中和抗體VRC01敏感性的分子機制研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)膜區(qū)的糖蛋白具有高度的變異性，可以導(dǎo)致病毒逃逸人體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)，是人類研究有效的艾滋病疫苗的主要障礙。在過去四年中，通過綜合應(yīng)用先進的技術(shù)策略，研究者們分離發(fā)現(xiàn)了多個完全人源的具有高效中和能力的單克隆廣譜中和抗體。根據(jù)廣譜中和抗體設(shè)計相應(yīng)的疫苗成為HIV-1疫苗研究的熱點方向。VRC01，是研究者采用高通量特異性擴增單個B細胞抗體的技術(shù)于2010

2、年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜中和活性的單克隆抗體。研究表明，VRC01作用于HIV-1膜蛋白表面的CD4結(jié)合位點，主要作用于gp120蛋白的loop D區(qū)域、CD4結(jié)合區(qū)和V5區(qū)域。VRC01能夠高效中和90％以上的國內(nèi)外HIV-1流行株。但在研究中仍發(fā)現(xiàn)了少數(shù)的分離毒株對VRC01具有不同程度的耐受，深入研究這些流行毒株對廣譜中和抗體VRC01的耐受機制，并闡明耐受株在體內(nèi)免疫選擇壓力作用下對VRC01的中和敏感性的變化規(guī)律，能夠幫助人們更好地了

3、解病毒與廣譜中和抗體的相互作用機制，同時能夠為抗體相關(guān)疫苗的研制和應(yīng)用提供重要的信息。
　　 為了研究中國HIV-1流行株與廣譜中和抗體VRC01的相互作用特點并揭示流行株中耐受毒株的耐受機制，本研究首先通過序列比對分析和假病毒的中和實驗篩選到分離自同一份HIV-1 CRF08_ B'C亞型感染者樣本的兩株病毒CNE47和CNE48，這兩株病毒的膜蛋白序列高度相似，94％以上的氨基酸序列完全相同，在與VRC01相互作用的主要區(qū)域

4、中，loopD區(qū)域僅有一個氨基酸的差異，CD4結(jié)合區(qū)則完全相同，V5區(qū)域有4個氨基酸不同。但是這兩株病毒對VRC01的中和敏感性相差24倍左右，其中CNE47對VRC01相對不敏感(IC50=9.27μg/ml)，對VRC01表現(xiàn)出一定程度的耐受，而CNE48則對VRC01高度敏感(IC50=0.39μg/ml)。對CNE47和CNE48的loop D和/或V5區(qū)域進行了整體互換和單個氨基酸的突變，結(jié)果表明，包含有V5區(qū)域互換的突變株對

5、VRC01的中和敏感性都發(fā)生了明顯的變化。因此，V5區(qū)域的不同是導(dǎo)致CNE47和CNE48對VRC01中和敏感性不同的主要原因。另外，將CNE47的460位的天門冬酰胺突變?yōu)楸彼?N460A)時，可以顯著增強病毒對VRC01的中和敏感性。我們選取了來自不同感染者的毒株CNE23和CNE30進行了進一步的驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些毒株中，V5區(qū)域同樣是決定病毒對VRC01中和敏感性的主要區(qū)域，其中460位的天門冬酰胺(N460)也能夠促進病

6、毒對VRC01的耐受。結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果表明，HIV-1 gp120的460位的天門冬酰胺可以增加VRC01重鏈的61位精氨酸與gp120之間的空間位阻，進而促進病毒對VRC01的耐受。假病毒的膜蛋白與VRC01的結(jié)合實驗證明，病毒對VRC01的結(jié)合能力決定了其對VRC01的中和敏感性。隨后，我們研究了含有突變的病毒對其它的CD4結(jié)合位點相關(guān)蛋白和抗體的敏感性變化，結(jié)果表明:loop D和V5區(qū)域的變化都沒有明顯影響病毒對b12的敏感性;

7、在突變株中僅有包含有潛在糖基化位點的突變降低了相應(yīng)假病毒對Ibalizumab的中和敏感性，但V5區(qū)域的變化促進了病毒對可溶性CD4(soluble CD4，sCD4)蛋白的不同程度的中和耐受。
　　 為了進一步研究在免疫選擇壓力下，體內(nèi)病毒種群的變化情況和病毒對VRC01中和敏感性的變化情況，我們對分離出CNE47和CNE48的50號感染者的后續(xù)兩個時間點的系列樣本進行了研究。首先從后續(xù)樣本中擴增出了大量的HIV-1膜蛋白基因

8、，通過序列分析、假病毒構(gòu)建和中和實驗等方法研究了代表性毒株對VRC01及其它CD4結(jié)合位點相關(guān)抗體的中和敏感性的變化。結(jié)果表明，分離自同一份樣本的HIV-1膜蛋白序列的親緣關(guān)系最近。在gp120與VRC01相互作用的主要區(qū)域中，與CNE47相比，后續(xù)系列樣本中分離出的病毒膜蛋白的loop D區(qū)和CD4結(jié)合區(qū)完全相同，V5區(qū)域存在1個或5個氨基酸的差異。代表克隆對VRC01、b12和Ibalizumab的中和敏感性均與CNE47相似。這說

9、明，在50號感染者體內(nèi)，后續(xù)時間點分離出的所有毒株均對VRC01耐受。通過本研究可以得出以下結(jié)論:
　　 1、在HIV-1中，gp120蛋白的V5區(qū)域是決定病毒對VRC01中和敏感性的主要區(qū)域。
　　 2、V5區(qū)域中460位的天門冬酰胺能夠促進病毒對VRC01的耐受。
　　 3、HIV-1膜蛋白與VRC01的結(jié)合能力決定了病毒對VRC01的中和敏感性。
　　 4、在同一感染者體內(nèi)可以同時存在對VRC01中