家蠶對細(xì)小病毒樣病毒(中國株)非敏感性因子的初步研究.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(B.mori Parvo-like Virus，BmPLV)，過去稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型，是夏秋季養(yǎng)蠶中常見的軟化病病原，也是蠶業(yè)上危害較大的病毒之一。細(xì)小病毒樣病毒已知毒株有日本的山梨株和中國鎮(zhèn)江株(BmPLV-Z)。有部分家蠶品種對此病毒表現(xiàn)完全不感染，這種抵抗性分別由兩個(gè)隱生單基因(山梨株nsd-2；鎮(zhèn)江株nsd-Z)控制。形態(tài)遺傳學(xué)研究表明：nsd-2位于第17連鎖群，nsd-Z位于第15連鎖群。對家蠶抵抗細(xì)小

2、病毒樣病毒機(jī)制目前尚不清楚。
　　 2008年，Kidokoro等依據(jù)抗性分子標(biāo)記，利用染色體步移法克隆了家蠶細(xì)小病毒樣病毒山梨株的非敏感性基因nsd-2。該突變基因是由其野生型+nsd-2基因的部分缺失造成。敏感性基因+nsd-2是一個(gè)由十四個(gè)外顯子組成的基因，編碼一個(gè)十二次跨膜蛋白，屬于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一。研究者通過轉(zhuǎn)基因的方法，證實(shí)+nsd-2基因可以介導(dǎo)病毒的感染。細(xì)小病毒樣病毒鎮(zhèn)江株在血清學(xué)和基因組結(jié)構(gòu)上與山梨

3、株具有很高的一致性。我們推測對鎮(zhèn)江株抗性或感性的家委品系中也存在有nsd-2和+nsd-2基因的同源基因nsd-2’和+nsd-2'，并且參與介導(dǎo)鎮(zhèn)江株的感染。
　　 本研究主要通過PCR擴(kuò)增和RT-PCR鑒定了對家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國鎮(zhèn)江株抗性/感性宿主的nsd-2'和+nsd-2'基因及其在宿主組織內(nèi)表達(dá)。從基因組DNA和mRNA水平上分析nsd-2'和+nsd-2'基因。對非敏感性nsd-2基因進(jìn)行原核表達(dá)，對敏感性+ns

4、d-2基因進(jìn)行桿狀病毒表達(dá)。
　　 1.對BmPLV-Z不同敏感性家蠶的nsd-2和+nsd-2的同源基因鑒定
　　 參照+nsd-2基因序列，設(shè)計(jì)覆蓋基因不同區(qū)域的三對引物D1、D2、D3，在對BmPLV-Z抗感性不同的家蠶品種基因組PCR分析，結(jié)果顯示，三對引物在對BmPLV-Z敏感性不同的家蠶品系中獲得的片段皆小于BmDNV-2中約300 bp，由三對引物的覆蓋范圍來看，推測在對BmPLV-Z敏感性不同的家蠶品種中

5、，第13個(gè)內(nèi)含子缺失約300 bp的堿基。對BmPLV-Z抗感性不同的家蠶品種mRNA的RT-PCR分析，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示nsd-2，和+nsd-2'在mRNA水平上與nsd-2和+nsd-2大小一致。
　　 通過RT-PCR分析了在敏感性家蠶的不同發(fā)育階段和不同組織中+nsd-2基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明，+nsd-2基因在家蠶一齡到五齡階段都有表達(dá)；而在組織分布上，該基因只在中腸組織中表達(dá)。
　　 2.nsd-2和+nsd

6、-2同源基因的克隆和功能域分析
　　 對nsd-2’和+nsd-2'基因編碼區(qū)克隆和測序。結(jié)果顯示，nsd-2，和+nsd-2’基因編碼區(qū)的堿基序列與山梨株的nsd-2和+nsd-2完全一致。暗示兩病毒具有相同的病毒入侵抵抗機(jī)制。功能域分析顯示，+nsd-2基因表達(dá)一個(gè)11次跨膜蛋白，且分別在155、178、520存在三個(gè)糖基化位點(diǎn)。通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫染色體定位顯示，該基因位于第11號染色體上。
　　 3.非敏感性基因

7、nsd-2的原核表達(dá)
　　 將家蠶非敏感性基因nsd-2編碼區(qū)序列，克隆到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-30a上，利用大腸桿菌Rosetta株系進(jìn)行表達(dá)，得到了分子量約27 kDa的融合蛋白，融合蛋白分子量大小與預(yù)期相符。Western blot分析表明所獲融合蛋白就是所要表達(dá)的目的蛋白，目的蛋白的表達(dá)量較低。
　　 4.敏感性基因+nSd-2的真核表達(dá)
　　 敏感性基因+nsd-2編碼區(qū)序列克隆到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒