家蠶對細小病毒樣病毒(中國株)非敏感性因子的初步研究.pdf

1、家蠶細小病毒樣病毒(B.mori Parvo-like Virus，BmPLV)，過去稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型，是夏秋季養(yǎng)蠶中常見的軟化病病原，也是蠶業(yè)上危害較大的病毒之一。細小病毒樣病毒已知毒株有日本的山梨株和中國鎮(zhèn)江株(BmPLV-Z)。有部分家蠶品種對此病毒表現(xiàn)完全不感染，這種抵抗性分別由兩個隱生單基因(山梨株nsd-2；鎮(zhèn)江株nsd-Z)控制。形態(tài)遺傳學研究表明：nsd-2位于第17連鎖群，nsd-Z位于第15連鎖群。對家蠶抵抗細小

2、病毒樣病毒機制目前尚不清楚。
　　 2008年，Kidokoro等依據(jù)抗性分子標記，利用染色體步移法克隆了家蠶細小病毒樣病毒山梨株的非敏感性基因nsd-2。該突變基因是由其野生型+nsd-2基因的部分缺失造成。敏感性基因+nsd-2是一個由十四個外顯子組成的基因，編碼一個十二次跨膜蛋白，屬于氨基酸轉運蛋白家族成員之一。研究者通過轉基因的方法，證實+nsd-2基因可以介導病毒的感染。細小病毒樣病毒鎮(zhèn)江株在血清學和基因組結構上與山梨

3、株具有很高的一致性。我們推測對鎮(zhèn)江株抗性或感性的家委品系中也存在有nsd-2和+nsd-2基因的同源基因nsd-2’和+nsd-2'，并且參與介導鎮(zhèn)江株的感染。
　　 本研究主要通過PCR擴增和RT-PCR鑒定了對家蠶細小病毒樣病毒中國鎮(zhèn)江株抗性/感性宿主的nsd-2'和+nsd-2'基因及其在宿主組織內(nèi)表達。從基因組DNA和mRNA水平上分析nsd-2'和+nsd-2'基因。對非敏感性nsd-2基因進行原核表達，對敏感性+ns

4、d-2基因進行桿狀病毒表達。
　　 1.對BmPLV-Z不同敏感性家蠶的nsd-2和+nsd-2的同源基因鑒定
　　 參照+nsd-2基因序列，設計覆蓋基因不同區(qū)域的三對引物D1、D2、D3，在對BmPLV-Z抗感性不同的家蠶品種基因組PCR分析，結果顯示，三對引物在對BmPLV-Z敏感性不同的家蠶品系中獲得的片段皆小于BmDNV-2中約300 bp，由三對引物的覆蓋范圍來看，推測在對BmPLV-Z敏感性不同的家蠶品種中

5、，第13個內(nèi)含子缺失約300 bp的堿基。對BmPLV-Z抗感性不同的家蠶品種mRNA的RT-PCR分析，擴增產(chǎn)物顯示nsd-2，和+nsd-2'在mRNA水平上與nsd-2和+nsd-2大小一致。
　　 通過RT-PCR分析了在敏感性家蠶的不同發(fā)育階段和不同組織中+nsd-2基因的轉錄情況，結果表明，+nsd-2基因在家蠶一齡到五齡階段都有表達；而在組織分布上，該基因只在中腸組織中表達。
　　 2.nsd-2和+nsd

6、-2同源基因的克隆和功能域分析
　　 對nsd-2’和+nsd-2'基因編碼區(qū)克隆和測序。結果顯示，nsd-2，和+nsd-2’基因編碼區(qū)的堿基序列與山梨株的nsd-2和+nsd-2完全一致。暗示兩病毒具有相同的病毒入侵抵抗機制。功能域分析顯示，+nsd-2基因表達一個11次跨膜蛋白，且分別在155、178、520存在三個糖基化位點。通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫染色體定位顯示，該基因位于第11號染色體上。
　　 3.非敏感性基因

7、nsd-2的原核表達
　　 將家蠶非敏感性基因nsd-2編碼區(qū)序列，克隆到帶有His標簽的原核表達載體pET-30a上，利用大腸桿菌Rosetta株系進行表達，得到了分子量約27 kDa的融合蛋白，融合蛋白分子量大小與預期相符。Western blot分析表明所獲融合蛋白就是所要表達的目的蛋白，目的蛋白的表達量較低。
　　 4.敏感性基因+nSd-2的真核表達
　　 敏感性基因+nsd-2編碼區(qū)序列克隆到轉移質粒