淋巴器官中的樹突狀細(xì)胞在神經(jīng)--免疫通路中的作用.pdf

1、目的：探討淋巴器官中的樹突狀細(xì)胞在神經(jīng)-免疫通路中的作用。
　　 方法：⑴實驗組：SD大鼠3只,體重260克±20克,雄性。采用SD鼠仰臥位,用手摸到SD大鼠的胸骨,在其上方沿頸部正中線剪開約3cm的切口,暴露右側(cè)頸上神經(jīng)節(jié),用連接微量注射器的玻璃微管往頸上神經(jīng)節(jié)緩慢注射1μl3％FR,留針15分鐘；縫合傷口,存活9天后灌注取材；對照組：SD大鼠2只,體重260克±20克,雄性。采用SD鼠仰臥位,用手摸到SD大鼠的胸骨,在其上方

2、沿頸部正中線剪開約3cm的切口,暴露右側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)(SCG),切除頸上神經(jīng)節(jié),在頸上神經(jīng)節(jié)切除處滴1μl3％FR,縫合傷口,存活9天后灌注取材。⑵選出FR標(biāo)記的頸淋巴結(jié)組織切片用0.01M PBS漂洗(5min×3次),滴加二甲基亞砜稀釋的DiOC18(3)(1:80),室溫30min,0.01M PBS漂洗(5min×3次)；室溫下DAPI染核30min,0.01M PBS漂洗(5min×3次)；液體石蠟封片,在共聚焦顯微鏡下觀察。⑶

3、選出FR標(biāo)記的頸淋巴結(jié)組織切片用0.01M PBS漂洗(5min×3次),血清封閉30min,甩干,分別滴加0.01M PBS適當(dāng)稀釋的不同的一抗CD3(1:500),CD14(1:500),CD22(1:500),S100(1:500),NPY(1:500)和VIP(1:500),4℃過夜；第二天用0.01M PBS漂沈(5min×3次),滴加和一抗對應(yīng)的生物素化,二抗IgG(1:100),37℃30min,0.01M PBS漂洗(5

4、min×3次)；加0.01M PBS稀釋的SABC-FITC(1:100),37℃30min,0.01M PBS漂洗(5min×4次)；室溫下DAPI染核30min,0.01M PBS漂洗(5 min×3次)；液體石蠟封片,在共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果：① 注射FR到頸上神經(jīng)節(jié)后,在共聚焦熒光顯微鏡下觀察頸淋巴結(jié)切片,頸淋巴結(jié)中可見到紅色熒光標(biāo)記到的神經(jīng)終末纖維,這說明來自頸上神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)末梢被FR標(biāo)記,但標(biāo)記到的神經(jīng)

5、纖維只位于淋巴結(jié)組織中某一些細(xì)胞核的周圍,這預(yù)示著這種被交感神經(jīng)纖維圍繞的細(xì)胞在神經(jīng)免疫通路中可能起關(guān)鍵作用。②從順行追蹤的結(jié)果已知交感神經(jīng)只圍繞淋巴結(jié)中某一些細(xì)胞分布,為了確定FR標(biāo)記的交感神經(jīng)末梢與圍繞細(xì)胞之間的位置關(guān)系,我們用DiOC18(3)標(biāo)記細(xì)胞膜,共聚焦顯微鏡觀察到標(biāo)記交感神經(jīng)末梢的紅色熒光與標(biāo)記細(xì)胞膜的綠色熒光重疊,這一結(jié)果表明交感神經(jīng)末梢位于細(xì)胞膜上。③為了確定FR標(biāo)記的交感神經(jīng)末梢是圍繞淋巴器官中哪類細(xì)胞分布,我們分

6、別用抗T細(xì)胞(CD3)、B細(xì)胞(CD22)、巨噬細(xì)胞(CD14)和樹突狀細(xì)胞(S100)的特異性抗體去雙標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FR標(biāo)記的交感神經(jīng)末梢圍繞的細(xì)胞不表達(dá)CD3、CD22和CD14而表達(dá)S100,這結(jié)果表明FR標(biāo)記的交感神經(jīng)末梢不支配T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞而只支配樹突狀細(xì)胞。另外,還發(fā)現(xiàn)FR標(biāo)記的交感神經(jīng)未梢有NPY和VIP的共存。
　　 結(jié)論：⑴從形態(tài)上證實交感神經(jīng)只支配淋巴器官中的樹突狀細(xì)胞,與其它淋巴細(xì)胞(如T、B、巨噬