鴨坦布蘇病毒E和NSI基因序列分析及其重組蛋白的初步應用.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病自2010年4月以來，在我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)，該病主要引起肉鴨的神經(jīng)癥狀、產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋量急劇下降，傳播非常迅速，波及范圍較大，給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。
　　 為給該病的流行病學調查以及后續(xù)疫苗的研制提供免疫效果評價的依據(jù)，本研究成功表達了囊膜蛋白E和非結構蛋白NS1，并分別建立了E蛋白和NS1蛋白間接ELISA檢測方法，與血清中和試驗相比，間接ELISA檢測方法省時省力且成本低廉，更適用于大批量樣品檢測。本研

2、究還對鴨坦布蘇病毒E基因和NS1基因進行了序列分析，為鴨坦布蘇病毒病防控技術的研究提供了依據(jù)。
　　 本研究主要分為3部分:
　　 1.鴨坦布蘇病毒E基因、NS1基因的序列分析
　　 將E基因和NS1基因的測序結果利用DNAstar軟件包MegAlign程序進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)DTMUV的E蛋白與NS1蛋白與登革熱病毒、黃熱病毒等常見且危害嚴重的黃病毒的氨基酸同源性較低，僅在48-50％之間，而與1955年從馬

3、來西亞吉隆坡庫蚊中分離到的Tembusu virus和2000年從馬來西亞發(fā)病肉雞中分離到的Sitiawan virus的氨基酸同源性很高，均在93％以上。利用MEGA4.0生物學軟件分別對鴨坦布蘇病毒的E基因和NS1基因進行遺傳進化分析，通過系統(tǒng)進化樹可以發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒LC-10株與Tembusu virus和Sitiawan virus有較近的親緣關系，而與登革熱病毒、黃熱病毒等的親緣關系較遠。
　　 2.鴨坦布蘇病毒E

4、基因的原核表達及初步應用
　　 參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列，設計一對特異性引物，利用PCR方法從鴨坦布蘇病毒山東分離株（LC-10株）擴增出整個E基因，全長1503bp，將其克隆到pMD18-T載體中，然后將雙酶切的目的片段亞克隆入pET-28a(+)載體，成功構建出重組表達質粒PET28a-E。將PET28a-E轉化BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導可表達出約58KD的蛋白，經(jīng)Western blotti

5、ng分析呈陽性，表明E蛋白具有很好的反應原性。（楊少艷等，2012以純化的E蛋白作為包被抗原，鴨坦布蘇病毒血清作為一抗，HRP標記的羊抗鴨IgG作為二抗建立間接ELISA方法。采用該方法對80份送檢鴨血清進行檢測，并與中和試驗進行比較，結果顯示，兩者符合率為95.0％，表明該方法具有較好的應用前景(楊少艷等，2012)。
　　 3.鴨坦布蘇病毒NS1蛋白的原核表達及初步應用
　　 黃病毒的非結構蛋白NS1是在病毒感染細胞

6、時產(chǎn)生的，因此可利用NS1蛋白來區(qū)分自然感染和滅活苗免疫產(chǎn)生的抗體。故本研究參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列，設計一對特異性引物，利用RT-PCR技術擴增鴨坦布蘇病毒的NS1基因，利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)對鴨坦布蘇病毒的NS1蛋白進行重組表達，經(jīng)IPTG誘導，表達出分子量約為43KD的蛋白，Western blotting分析呈陽性，說明表達的NS1蛋白有很好的反應原性。利用純化的NS1蛋白作為包被抗原，以鴨坦布蘇病毒陽性血