大蒜素衍生物對巨噬細(xì)胞骯癌作用的調(diào)控及其構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、本課題選取以了大蒜素(丙烯三硫醚)為模板合成的四種不飽和的衍生物：二(3-丁烯基)三硫醚、二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚、二(4-戊烯基)三硫醚和二(5-己烯基)三硫醚。比較這五化合物對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的刺激活性，并且對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離的刺激藥物和溫度條件進(jìn)行篩選，以便最大程度獲取巨噬細(xì)胞。探究五種化合物在不同濃度下通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子對巨噬細(xì)胞的形態(tài)，活力和吞噬能力以及對巨噬細(xì)胞抗癌作用的細(xì)胞因子(白介素-2、腫瘤壞死

2、因子-a和干擾素-γ)和NO，SOD等相關(guān)因子的水平的影響產(chǎn)生的抗癌作用，并篩選出藥理活性較好的一到兩種衍生物。對大蒜素及其衍生物的結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析，找出其與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系，為以后合成藥理活性以及穩(wěn)定性更好大蒜素衍生物提供依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)中用硫代乙醇鈉刺激在37℃條件下培養(yǎng)的小鼠能最大程度的獲取巨噬細(xì)胞。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大蒜素及其衍生物能夠活化巨噬細(xì)胞使其體積增大。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)濃度低于16μg/mL的大蒜素及其

3、衍生物對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞活力沒有顯著性影響，在各濃度組均能不同程度的提高巨噬細(xì)胞對中性紅的吞噬能力，隨著同一化合物濃度的增加，呈劑量依賴性關(guān)系。其中二(3-丁烯基)三硫醚效果最好，在160μg/mL濃度下巨噬細(xì)胞吞噬中性紅用酶標(biāo)儀在490nm測定OD值為0.270±0.018，與空白組0.120±0.005比較吞噬能力提高2.2倍。
　　 本實(shí)驗(yàn)檢測了大蒜素衍生物介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對PC-3細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，通過對PC-3細(xì)胞凋亡

4、率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)在20μg/mL濃度下大蒜素及其衍生物通過巨噬細(xì)胞使PC-3細(xì)胞凋亡的能力提高不顯著，濃度提升到在40μg/mL時，各化合物組對PC-3細(xì)胞的凋亡百分率急劇升高，呈劑量依賴性關(guān)系，其中二(3-丁烯基)三硫醚、二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚在最高濃度下的凋亡率都在85％以上。用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測巨噬細(xì)胞因子(IL-2、TNF-a和IFN-γ)的分泌量，結(jié)果表明在20μg/mL濃度下IL-2、TNF-a和IFN-γ的分泌量都沒

5、有顯著的增加，隨著同一化合物濃度的增加，分泌量有不同程度的增加，呈劑量依賴性關(guān)系，化合物對IL-2、TNF-a的增加刺激效果顯著，IFN-γ除在160μg/mL濃度下刺激性顯著外，其他濃度效果不顯著。用Griess法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2-的量，來間接反映巨噬細(xì)胞釋放NO的量，在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24h和36h下進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，隨著藥物作用濃度和時間的增加，NO釋放量的上升呈濃度和時間依賴性趨勢。用鄰苯三酚檢測法測定了巨噬細(xì)胞SOD水

6、平，化合物在160μg/mL濃度下能夠增加SOD的水平。在巨噬細(xì)胞內(nèi)加入Fμra-2，用熒光分光光度儀檢測熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子量，結(jié)果表明，同一化合物濃度增加到80μg/mL時，巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度呈顯著性增加，呈劑量依賴性關(guān)系。高于80μg/mL時，巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子有所降低，呈緩慢下降的趨勢。
　　 用Chemoffice中的MM2方法對大蒜素及其衍生物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)能量優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)隨著大蒜素衍生物碳原子數(shù)的

7、增加和碳鏈的延長，水性參數(shù)ClogP值從3.71逐漸增大到5.73，同分異構(gòu)體二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚的ClogP大于二(4-戊烯基)三硫醚；HF和總能量逐漸減小，同分異構(gòu)體二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚HF值為30.61比二(4-戊烯基)三硫醚19.28幾乎高一倍，總能量卻幾乎相同。與前面研究藥理活性結(jié)果比較，當(dāng)ClogP值大于4.8時，繼續(xù)延長碳鏈對大蒜素衍生物的藥理活性沒有提高，同分異構(gòu)體之間HF越大，其衍生物生物活性越

8、大。分子總能量隨著碳鏈的延長逐漸減小，衍生物的穩(wěn)定性可能會提高。
　　 綜上所述，大蒜素及其衍生物能夠刺激巨噬細(xì)胞的抗癌能力，在160μg/mL濃度下對細(xì)胞的體外生長無毒副作用，在各濃度下均能提高巨噬細(xì)胞的吞噬和使癌細(xì)胞凋亡的能力。主要通過活化巨噬細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平，介導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2、TNF-a，和NO，SOD的濃度來發(fā)揮抗癌作用，IFN-γ在此過程中水平升高不顯著。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，二(3-丁烯基)三硫醚、二