用腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)和人全基因芯片技術(shù)篩選鼻咽癌差異表達(dá)基因.pdf

1、目的:本研究采用寡核苷酸探針基因芯片技術(shù)，結(jié)合腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，研究鼻咽癌基因表達(dá)譜差異基因，并對鼻咽癌的發(fā)病機制進(jìn)行初步探討。為鼻咽癌的早期診斷、預(yù)后判斷及治療方案的選擇提供理論依據(jù)。 方法:取鼻咽癌和鼻咽慢性炎癥的新鮮組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，對所獲得的細(xì)胞分別用細(xì)胞角蛋白(CK)免疫細(xì)胞化學(xué)、EBER1原位雜交、EBV-DNA熒光定量PCR等方法驗證。抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)雙色熒光標(biāo)記后和人全基因表達(dá)譜芯片雜交

2、，構(gòu)建鼻咽癌原代細(xì)胞的全基因表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析數(shù)據(jù)，確定鼻咽癌差異表達(dá)基因。 結(jié)果:1鼻咽癌細(xì)胞差異表達(dá)基因篩選①經(jīng)原代培養(yǎng)后獲得5例鼻咽癌細(xì)胞和3鼻咽正常上皮細(xì)胞，上述原代細(xì)胞及鼻咽癌細(xì)胞株C666的總RNA提取和質(zhì)檢結(jié)果理想。6組芯片雜交結(jié)果顯示，所有陽性對照(管家基因)的雜交信號清晰，陰性對照的雜交信號很低，提示芯片雜交效果良好。 ②根據(jù)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)(ratio＞2，為基因表達(dá)上調(diào)；ratio＜0.5

3、，為基因表達(dá)下調(diào))，四例以上共同表達(dá)的差異基因有493個，包括上調(diào)基因264個，下調(diào)基因229個。對其中四例(NPC31、NPC43、NPC47和C666，經(jīng)聚類分析表達(dá)譜相似的)鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行初步篩選，其中3例以上符合上述標(biāo)準(zhǔn)的差異表達(dá)基因共有636個，包括上調(diào)基因394個，下調(diào)基因242個。該636個基因中，包括細(xì)胞周期相關(guān)基因81個；細(xì)胞粘連蛋白15個；凋亡相關(guān)基因10個；分化相關(guān)基因4個；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因50個；轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因

4、25個；代謝相關(guān)基因25個；細(xì)胞運動相關(guān)基因7個；發(fā)育相關(guān)基因34個；逆境反應(yīng)蛋白34個；細(xì)胞組織與生物發(fā)生相關(guān)基因23個等。 2熒光定量PCR驗證差異基因①表達(dá)譜芯片中篩選出的4個表達(dá)上調(diào)基因ANLN、CENPF、MCM2和CDC6，在NPC43和NPC47熒光信號值Cy3/Cy5(ratio)，分別為43.8和84.4，28.4和68.7，3.1和3.4，2.5和2.9。熒光定量PCR檢測NPC43和NPC47的表達(dá)差異倍數(shù)

5、分別為25.3和77.7，12.7和71.4，7.5和4，5.1和4.9，兩種技術(shù)檢測的結(jié)果基本相符，即該4個基因在鼻咽癌原代細(xì)胞的表達(dá)比在正常細(xì)胞的表達(dá)顯著升高。同時，檢測CNE-1和SUNE-1中該4個基因的表達(dá)，基因差異倍數(shù)分別為：64.9和222，187和110，2.16和2.3，7.8和2.1，與表達(dá)譜芯片檢測的該4個基因的表達(dá)趨勢相同，在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果也證明了，ANLN、CENPF、MCM2和CDC

6、6在鼻咽癌的原代細(xì)胞及細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，為高表達(dá)基因。 ②表達(dá)譜芯片中篩選出的4個表達(dá)下調(diào)基因TGM3、NDRG1、SERPINB13和MAL，在NPC43和NPC47熒光信號值Cy3/Cy5(ratio)的倒數(shù)，即正常細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞的差異倍數(shù)，分別為4.9和4.1，3.3和19.5，10和4.7，31.1和146.1。熒光定量PCR檢測正常細(xì)胞和鼻咽癌原代細(xì)胞NPC43和NPC47的表達(dá)差異倍數(shù)分別為13和4.3，2.5和1

7、2.4，23.9和2.6，2.2和54.4，兩種技術(shù)檢測的結(jié)果趨勢相同，即該4個基因在正常鼻咽上皮細(xì)胞的表達(dá)比在鼻咽癌原代細(xì)胞的表達(dá)顯著增高；同時，檢測CNE-1和SUNE-1中該4個基因的表達(dá)，結(jié)果示：正常鼻咽上皮細(xì)胞與鼻咽癌細(xì)胞株的基因差異倍數(shù)分別為：45.8和24.4，4.8和6.4，65.4和2.3，12.5和10.1，與表達(dá)譜芯片檢測的該4個基因的表達(dá)趨勢相同，在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果也證明了，TGM3、ND

8、RG1、SERPINB13和MAL在鼻咽癌的原代細(xì)胞及細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，為低表達(dá)基因。 3免疫組織化學(xué)染色驗證差異基因的表達(dá)MCM2和CDC6在鼻咽癌組織中存在表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)分別定位于腫瘤細(xì)胞胞核和腫瘤細(xì)胞的胞漿及胞膜。對50例鼻咽癌組織和20例鼻咽慢性炎癥組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，其中，MCM2在鼻咽癌組織和慢性炎癥組織中的陽性率分別為94％(47/50)和60％(12/20)；CDC6在鼻咽癌組織和慢性炎癥組織中的陽性率

9、分別為90％(45/50)和45％(7/20)。兩種組織中的表達(dá)存在顯著性差異(P＜0.001)，即MCM2和CDC6在鼻咽癌組織中均為高表達(dá)。 結(jié)論:1鼻咽癌細(xì)胞存在廣泛的差異表達(dá)基因，這些基因包括細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞粘連蛋白、凋亡相關(guān)基因、分化相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)、代謝相關(guān)基因、細(xì)胞運動相關(guān)基因、發(fā)育相關(guān)基因、逆境反應(yīng)蛋白、細(xì)胞組織與生物發(fā)生相關(guān)基因等。 2鼻咽癌細(xì)胞中ANLN、CENPF、MC