Urocortin對(duì)缺氧-復(fù)氧后大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2家族的影響.pdf

1、冠心病是威脅人類健康的重要疾病，以冠脈阻塞事件引起心肌缺血損傷為特征的急性冠脈綜合征病人構(gòu)成社會(huì)總住院或死亡人數(shù)的較大部分。再灌注治療以解除主要阻塞冠脈快速恢復(fù)血流為目標(biāo)，包括溶栓、血管成型術(shù)、冠脈搭橋手術(shù)。再灌注治療對(duì)尚未發(fā)生不可逆損傷的心肌細(xì)胞供氧并使其恢復(fù)代謝、修復(fù)損傷，能夠挽救幸存心肌、限制心肌缺血損傷擴(kuò)展，已成為現(xiàn)代急性冠脈綜合征治療的基石。然而，近來的研究結(jié)果表明對(duì)缺血心肌的再灌注可促使一部分心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是人類

2、心肌梗死早期主要細(xì)胞死亡形式并在再灌注時(shí)增加。因此臨床亟待應(yīng)用心肌保護(hù)措施以減輕再灌注治療引起的心肌損傷。 凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2家族包括抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等和促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bad、Bak等成員。它們以保守序列區(qū)(Bcl-2homologydomains，BH)為特征。抗凋亡蛋白含有BH1-4區(qū)而促凋亡蛋白含有BH1-3區(qū)或僅有BH3區(qū)。損傷信號(hào)引起促凋亡蛋白Bax和Bad從胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體，Ba

3、x寡聚化形成線粒體膜上孔隙或引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)開放，釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等物質(zhì)觸發(fā)凋亡。Bcl-2家族成員相互競(jìng)爭(zhēng)形成同型或異型二聚體，調(diào)控線粒體變化。研究顯示Bcl-2家族蛋白參與心肌梗死、缺血預(yù)處理等多種缺血再灌注損傷相關(guān)事件。 1995年VaughanJ等從大鼠中腦克隆出一種40個(gè)氨基酸組成的肽鏈并命名為Urocorti

4、n。Urocortin屬于促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotrophinreleasinghormone，CRH)家族。Urocortin與心臟表達(dá)的CRH-receptor2結(jié)合通過自分泌和旁分泌方式發(fā)揮心血管調(diào)節(jié)功能，參與多種生理和病理環(huán)境下機(jī)體心血管反應(yīng)。研究顯示缺血時(shí)，Urocortin的mRNA和肽合成增加并能減輕心臟缺血再灌注損傷。Urocortin心臟保護(hù)機(jī)制相關(guān)研究顯示，Urocoritn可能通過激活多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)多

5、種蛋白，抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。 本課題研究Urocortin對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞Bcl-2家族蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)Urocortin通過上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達(dá)及磷酸化Bad蛋白抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，為Urocortin臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 第一部分Urocortin對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)效應(yīng) 目的:觀察Urocortin對(duì)大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響。 方法:培

6、養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞并缺氧/復(fù)氧處理。用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 結(jié)果:Urocortin治療組TUNEL陽性細(xì)胞率與缺氧/復(fù)氧組相比顯著降低(23.6±6.8％vs52.8％±11.4％，P＜0.01)，Urocortin+LY294002處理組較Urocortin治療組增加(46.3％±7.8％，P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示缺氧/復(fù)氧組、Urocortin治療組、Urocortin+LY294002組早期凋亡細(xì)

7、胞(An+PI-陽性細(xì)胞)百分率分別為：14.3％±3.6％、5.3％±2.2％、12.1％±2.7％，Urocortin治療組較缺氧/復(fù)氧組和Urocortin+LY294002組早期凋亡細(xì)胞百分率明顯減少(P＜0.01)。 結(jié)論:Urocortin減少大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制子LY294002抑制該效應(yīng)。 第二部分Urocortin對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞Bcl-2家族表達(dá)的影響

8、 目的:觀察Urocortin對(duì)缺氧/復(fù)氧后大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2家族表達(dá)的影響。 方法:培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞并缺氧/復(fù)氧處理。RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad、BclxLmRNA水平，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果Urocortin治療組Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)較缺氧/復(fù)氧組增加，BaxmRNA和蛋白表達(dá)較缺氧/復(fù)氧組減少(P＜0.01)，缺氧/復(fù)氧組和Urocort

9、in治療組Bad、BclxLmRNA水平無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論:Urocortin抑制Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，可能與其抗凋亡效應(yīng)相關(guān)。 第三部分Urocortin對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞Bad蛋白磷酸化狀態(tài)的影響 目的:觀察Urocortin對(duì)缺氧/復(fù)氧后大鼠心肌細(xì)胞Bad蛋白磷酸化的影響。 方法:培養(yǎng)心肌細(xì)胞分正常組、缺氧/復(fù)氧組、Urocortin治療組、Urocortin+L

10、Y294002組。WesternBlot和免疫沉淀法檢測(cè)細(xì)胞Bad和ser136磷酸化的Bad蛋白水平。 結(jié)果:缺氧/復(fù)氧組和Urocortin治療組Bad蛋白水平無顯著差異(P＞0.05)。Urocortin治療組ser136磷酸化的Bad蛋白水平較缺氧/復(fù)氧組增加，較Urocortin+LY294002組減少(P＜0.01)。 結(jié)論:Urocortin可能通過PI3K酶磷酸化大鼠缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bad