酮康唑、特比萘芬聯(lián)合中藥單體抗馬拉色菌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、馬拉色菌是人體和其他溫血?jiǎng)游锲つw表面的正常菌群，與花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎等皮膚病有關(guān)。自1889年Baillon首次提出馬拉色菌的概念以來，其命名和分類經(jīng)歷了一個(gè)長(zhǎng)期的演變過程，直到20世紀(jì)90年代中期，人們基于形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、生理生化特征以及分子生物學(xué)的研究，將馬拉色菌分為糠秕馬拉色菌(M.furfur)、球形馬拉色菌(M.globosa)、鈍形馬拉色菌(M.obtusa)、厚皮馬拉色菌(M.pachyder

2、matis)、限制性馬拉色菌(M.restricta)、斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)和合軸馬拉色菌(M.sympodialis)等7個(gè)種進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到由于馬拉色菌各菌種的生理生化特征的不同，其對(duì)抗真菌藥物的敏感性亦存在差異。近年來，國(guó)外學(xué)者針對(duì)馬拉色菌的新分類法進(jìn)行了為數(shù)不多的藥敏實(shí)驗(yàn)研究。 隨著馬拉色菌相關(guān)皮膚病如花斑癬，馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎等逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，因其病譜廣，患者眾多，開發(fā)高效低毒的抗

3、馬拉色菌藥物就顯得尤為重要。而化學(xué)合成一種新的抗真菌化合物，周期長(zhǎng)耗費(fèi)人力物力巨大，我國(guó)中醫(yī)中藥對(duì)真菌感染的治療歷史悠久，積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，因此從中草藥及其提取物中篩選出具有抗馬拉色菌作用的藥物，并與西藥聯(lián)合應(yīng)用，不僅降低化學(xué)合成藥物的治療量，而且還可減低其不良反應(yīng)，增強(qiáng)殺菌效果并防止耐藥發(fā)生。該研究在此方面進(jìn)行了一些初步探索。 國(guó)內(nèi)外關(guān)于中草藥抗馬拉色菌的相關(guān)報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)羅東輝等報(bào)道了用肉桂醛和茴香醛抗糠秕孢子菌的研究，杜青云

4、等報(bào)道了姜黃揮發(fā)油洗劑對(duì)糠秕孢子菌的抑菌實(shí)驗(yàn)研究，朱敏等報(bào)道了23種中草藥及14種單體抗馬拉色菌的體外藥敏研究。國(guó)外Hammer和Weseler等報(bào)道了茶樹油抗馬拉色菌的實(shí)驗(yàn)研究。在國(guó)內(nèi)外為數(shù)不多的馬拉色菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)報(bào)道中表明酮康唑、特比萘芬對(duì)馬拉色菌均較敏感。 目的 1、對(duì)院門診收集到的馬拉色菌臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，觀察來自于不同病源的馬拉色菌菌種的構(gòu)成比是否存在差異。 2、通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)馬拉色菌

5、抑菌作用較好的中藥單體，并將其與酮康唑、特比萘芬分別聯(lián)合用藥，觀察中西藥聯(lián)合用藥對(duì)馬拉色菌的體外抑菌作用。 3、將篩選出的對(duì)馬拉色菌抑菌作用較好的中西藥聯(lián)合用藥，通過電鏡和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，從細(xì)胞、亞細(xì)胞水平研究中西藥聯(lián)合用藥對(duì)馬拉色菌的抗菌機(jī)制和抑菌作用。 4、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察中西藥聯(lián)合用藥對(duì)皮膚馬拉色菌感染的體內(nèi)抑菌作用。為開發(fā)高效低毒的抗馬拉色菌藥物提供理論依據(jù)。 方法 1、對(duì)從花斑癬、馬拉色菌毛囊

6、炎、脂溢性皮炎、頭皮屑和正常人頭及額部來源的108株馬拉色菌通過生理生化特性及形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，觀察各菌種與各種皮膚病的關(guān)系。 2、參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLC)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對(duì)8種中藥單體苦參堿，氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚、鹽酸小檗堿、黃芩昔、丹皮酚、肉桂酸進(jìn)行抗馬拉色菌的體外藥敏實(shí)驗(yàn)，從中篩選出對(duì)馬拉色菌抑菌作用較好的中藥單體，將其分別與酮康唑、特比萘芬聯(lián)合用藥，觀察中西藥聯(lián)合

7、用藥對(duì)馬拉色菌的體外抑菌作用。 3、通過透射電鏡觀察聯(lián)合用藥和兩藥單獨(dú)應(yīng)用對(duì)馬拉色菌作用12h、24h時(shí)的抑菌作用及作用機(jī)制。 4、通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)聯(lián)合用藥及兩藥單獨(dú)應(yīng)用對(duì)馬拉色菌作用12h、24h時(shí)對(duì)其細(xì)胞周期的影響。 5、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察中西藥聯(lián)用對(duì)皮膚馬拉色菌感染的抑菌作用，該文首先構(gòu)建了豚鼠皮膚馬拉色菌感染的模型，然后采用自身對(duì)照法，比較了在豚鼠皮膚馬拉色菌感染后用藥的第4天和第7天，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(聯(lián)合用

8、藥組及兩個(gè)單獨(dú)用藥組)和2個(gè)對(duì)照組(陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組)皮損處真菌菌落形成單位(CFU)的不同。 結(jié)果及結(jié)論 該研究共分五部分，分別從體外藥敏實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞、亞細(xì)胞水平研究及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)中西藥結(jié)合抗馬拉色菌的作用進(jìn)行了探討。 1、從花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、頭皮屑和正常人頭及額部分離出108株馬拉色菌通過對(duì)其生理生化特性及形態(tài)學(xué)特征鑒定出5個(gè)種，分別是M.sympodialis(32株)，M.furf

9、ur(19株)，M.globosa(47株)，M.obtusa(3株)，M.restricta(7株)，并經(jīng)多樣本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同皮膚病中馬拉色菌菌種構(gòu)成有差異性，該文從花斑癬病人中分離的馬拉色菌以M.sympodialis較多，其次為M.furfur,從馬拉色菌毛囊炎中分離出的馬拉色菌以M.globosa為主要菌種。 2、參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)

10、室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對(duì)8種中藥單體苦參堿，氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚、肉桂酸中篩選出4種中藥單體(苦參堿、氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚)對(duì)M.globosa(CBS7966)抑菌作用較好，然后將酮康唑、特比萘芬分別與麝香草酚、丁香酚組合成4種聯(lián)合用藥，對(duì)7種馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出酮康唑和麝香草酚的聯(lián)合用藥及特比萘芬與丁香酚的聯(lián)合用藥對(duì)馬拉色菌的

11、抑菌作用較好。然后將這2種聯(lián)合用藥對(duì)40株馬拉色菌臨床分離株用棋盤微量稀釋法進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥及特比萘芬與丁香酚聯(lián)合用藥對(duì)馬拉色菌具有協(xié)同抑菌作用的百分比分別為87.5％、52.5％，二者經(jīng)Fisher'sexacttest，P=0.001，表明差異有顯著性。 3、通過透射電鏡觀察酮康唑、麝香草酚單用和聯(lián)合用藥對(duì)球形馬拉色菌作用12h、24h時(shí)其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明麝香草

12、酚對(duì)球形馬拉色菌的作用位點(diǎn)可能在細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，酮康唑和麝香草酚兩藥聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用抑菌作用明顯，其超微結(jié)構(gòu)的改變與藥物作用時(shí)間呈正相關(guān)。 4、通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥及兩藥單獨(dú)應(yīng)用對(duì)球形馬拉色菌作用12h和24h時(shí)對(duì)其細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在12h時(shí)球形馬拉色菌S期及增殖指數(shù)PI％，聯(lián)合用藥組＞麝香草酚組＞酮康唑組，在24h時(shí)球形馬拉色菌S期及增殖指數(shù)PI％，聯(lián)合用藥組＜麝香草酚組＜酮康唑組，經(jīng)多樣

13、本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析3組用藥在不同的時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明藥物在作用一定時(shí)間后才能對(duì)球形馬拉色菌產(chǎn)生抑菌作用，使其DNA合成受抑制，增殖活性減低，酮康唑與麝香草酚聯(lián)合用藥抑菌作用優(yōu)于二者單獨(dú)用藥。 5、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥在體內(nèi)的抑菌作用，該文首先構(gòu)建了豚鼠皮膚馬拉色菌感染的模型，然后采用自身對(duì)照法，比較了在酮康唑和麝香草酚聯(lián)

14、合用藥和單獨(dú)用藥第4天和第7天時(shí)，皮損處真菌菌落形成單位(CFU)，經(jīng)多樣本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明在用藥第4天時(shí)酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥組與麝香草酚單獨(dú)用藥組及兩個(gè)對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在用藥第7天時(shí)，酮康唑組和麝香草酚聯(lián)合用藥與兩藥單獨(dú)應(yīng)用組及兩個(gè)對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步證實(shí)了體外藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果即酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥對(duì)馬拉色菌的抑菌作用優(yōu)于兩藥單