雄激素受體(AR)上調(diào)RNA結(jié)合蛋白QKI在去勢抵抗性前列腺癌中的作用.pdf

1、背景：在我國，前列腺癌占所有男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位。前列腺癌發(fā)病隱匿，早期多無典型癥狀，當被發(fā)現(xiàn)時大多已是晚期。使前列腺癌的早期預防和診斷顯得尤為困難。前列腺癌的早期診斷主要是根據(jù)血清中PSA的含量，直腸指診也是一個主要的輔助手段。前列腺癌內(nèi)分泌治療效果顯著，但是經(jīng)過12-18月的雄激素剝奪治療后，多數(shù)病人會不可避免地轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔–astration Resistant Prostate Cancer，CRPC）

2、。去勢抵抗性前列腺癌預后差，患者生活質(zhì)量嚴重下降，給患者帶來了十分嚴重的后果。因此，明晰去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展機制，有可能為前列腺癌的臨床治療提供新的方法。雄激素受體在去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用。目前，CRPC治療的靶點均集中在AR調(diào)控上游，而從CRPC的發(fā)生機制來看，僅僅對AR通路上游的抑制，并不能阻止AR對下游基因的過度活化。因此，從AR信號通路下游著手，或可探尋增敏 CRPC細胞的潛在治療靶點。

3、>　　QKI（quaking）是屬于STAR（signal transduction and activation of RNA）家族的一種RNA結(jié)合蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中參與髓鞘發(fā)育。QKI基因不同突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙，或于出生后10天表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強直性驚厥的發(fā)作而得名。除了在神經(jīng)系統(tǒng)中對于髓鞘的形成發(fā)揮重要功能以外，QKI蛋白還參與了細胞的大多數(shù)生物學過程，比如血管發(fā)生、細胞凋亡、

4、細胞黏附、細胞生長及形態(tài)形成和器官發(fā)生等。目前研究發(fā)現(xiàn)，QKI可能調(diào)控多達1430個下游靶基因，而其中有24％的基因參與細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，高度提示QKI可能在腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。AR與QKI之間是否存在調(diào)控關(guān)系，如果存在調(diào)控關(guān)系，那么對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有什么的作用目前尚未見到相關(guān)的文獻報道。因此，明確二者之間的調(diào)控關(guān)系以及對前列腺癌的影響將有助于進一步理解前列腺癌的演變情況，也有助于提供新的治療策略。
　　目的：

5、　　1、了解不同前列腺癌細胞系以及臨床腫瘤組織樣本中AR和QKI的分子和蛋白表達水平，明確二者是否有潛在的調(diào)控關(guān)系存在。
　　2、觀察表達內(nèi)源性AR的前列腺癌細胞系在ADT干預情況下，前列腺癌細胞中AR和QKI的表達變化，以及CRPC細胞中AR突變體的變化情況。
　　3、明確沉默AR對QKI表達的影響，以及對不同前列腺癌細胞周期和凋亡功能的影響。
　　4、明確沉默QKI對AR表達是否存在影響，以及對細胞周期和功能的影響

6、，初步探討存在影響可能的機制。
　　5、探究沉默QKI能否影響CRPC對抗雄藥物比卡魯胺的敏感性。
　　方法和結(jié)果：
　　1、提取臨床腫瘤組織樣本中的蛋白以及不同前列腺癌細胞系中的蛋白和分子，分別通過qRT-PCR和western blotting觀察不同前列腺癌細胞系中AR和QKI的mRN A和蛋白表達。我們發(fā)現(xiàn)在AR高表達的腫瘤組織樣本以及前列腺癌細胞系中，QKI的表達也明顯增高。這表明AR也許能夠調(diào)控QKI的表達

7、。通過對QKI啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子預測發(fā)現(xiàn)，可能有AR潛在的結(jié)合位點。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對QKI啟動子區(qū)結(jié)合位點分析，存在AR的結(jié)合位點，而且AR能夠正向調(diào)控QKI的活性。因此，AR可以正向調(diào)控QKI的表達。
　　2、碳吸附血清培養(yǎng)前列腺癌細胞以排除其它激素和細胞因子對AR的活化作用。我們采用碳吸附血清和生理濃度二氫睪酮來驗證雄激素對AR活化的調(diào)控。分別通過qRT-PCR和western blotting來觀察不同前列腺癌細胞

8、系中AR和QKI的mRNA和蛋白表達。通過qRT-PCR來觀察AR突變體以及靶基因在去雄條件下的表達變化。發(fā)現(xiàn)在ADT情況下，前列腺癌細胞系LNCaP和C4-2細胞中的AR和QKI表達均下降，加入二氫睪酮后培養(yǎng)，AR和QKI的表達有一定程度的恢復。進一步驗證了AR能夠正向調(diào)控QKI的表達。通過對C4-2中AR突變體及靶基因的檢測發(fā)現(xiàn)，突變體分子表達水平出現(xiàn)了與此相反的變化。表明在去勢抵抗性前列腺癌細胞中，AR突變體能夠在沒有雄激素存在的

9、情況下自我活化，從而有利于細胞的存活。
　　3、通過siRNA片段以及脂質(zhì)體2000細胞轉(zhuǎn)染來沉默 AR的表達，分別通過qRT-PCR和western blotting來檢測細胞中AR、QKI和PSA的mRNA和蛋白表達。通過流式細胞術(shù)來檢測沉默AR對前列腺癌細胞周期和凋亡功能的影響。發(fā)現(xiàn)沉默AR后QKI的蛋白和分子表達水平均下降，細胞發(fā)生周期阻滯，細胞凋亡增加。在細胞周期阻滯上，LNCaP和C4-2細胞表現(xiàn)不同，前者主要是發(fā)生了

10、G1/S期阻滯，后者為G2/M阻滯。UBE2c是G2/M的主要調(diào)控分子，C4-2中該基因表達明顯增高，這可能是C4-2發(fā)生G2/M阻滯的原因。
　　4、通過siRNA片段以及脂質(zhì)體2000細胞轉(zhuǎn)染來沉默QKI的表達，分別通過qRT-PCR和western blotting來檢測細胞中AR、QKI、PSA和HSP90的mRNA和蛋白表達。通過流式細胞術(shù)來檢測沉默QKI對前列腺癌細胞周期和凋亡功能的影響。發(fā)現(xiàn)沉默AR后QKI的蛋白和分

11、子表達水平均下降，HSP90分子表達水平明顯下降。兩株細胞均發(fā)生周期阻滯，細胞凋亡增加。在細胞周期阻滯上，LNCaP和C4-2細胞表現(xiàn)不同，前者主要是發(fā)生了G1/S期阻滯，后者為G2/M阻滯。此外還檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白caspase-12以及G1/S期蛋白P27，G2/M期蛋白P21。結(jié)果表明，凋亡蛋白和周期蛋白均明顯增高。
　　5、通過MTT來檢測細胞增殖功能。發(fā)現(xiàn)沉默了QKI后，CRPC細胞對抗雄藥物比卡魯胺的敏感性增加。