HIF-PHF8-AR軸在去勢抵抗前列腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：去勢治療仍然是針對局部進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的主要手段。遺憾的是，雖然大多數(shù)前列腺癌患者最初對去勢治療反應(yīng)敏感，但許多腫瘤最終都會(huì)從激素敏感性前列腺癌（HDPC）進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。近年的研究報(bào)道提示雄激素受體AR在CRPC進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵角色。而去勢誘導(dǎo)的低氧可以促進(jìn)AR轉(zhuǎn)錄激活和CRPC進(jìn)展，植物同源結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白8（PHF8）作為組蛋白去甲基化酶家族中一員，高表達(dá)于包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中。我們現(xiàn)在的研

2、究設(shè)計(jì)基于探索PHF8在去勢誘導(dǎo)的低氧和AR轉(zhuǎn)錄激活過程中扮演的關(guān)鍵作用。
　　研究方法：第一，免疫組織化學(xué)技術(shù)用于分析97例病人組織樣本，包括16例良性前列腺增生（BPH），16例前列腺上皮內(nèi)瘤變（PIN）和65例來自于組織芯片的前列腺癌病人?；诿庖呓M化染色評分，65例前列腺癌病人被分成PHF8高表達(dá)組（33例）和低表達(dá)組（32例）。Pearson卡方檢驗(yàn)分析PHF8表達(dá)與腫瘤相關(guān)變量的關(guān)系。實(shí)施Kaplan-Meier曲線對

3、隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析。第二，經(jīng)直腸彩色超聲多普勒用于分析去勢前后前列腺癌組織血供情況。免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)用于比較14例進(jìn)展性前列腺癌病人去勢前后PHF8, HIF1α and HIF2α表達(dá)水平差異。第三，在缺氧條件下(1％O2)培養(yǎng)三種前列腺癌細(xì)胞系LNCaP,22RV1 and DU145分別0,12和24h，用免疫印跡和熒光定量PCR技術(shù)分別檢測PHF8表達(dá)和mRNA表達(dá)。為了檢測低氧誘導(dǎo)的 PHF8表達(dá)是依賴于 HIF家族轉(zhuǎn)

4、錄因子調(diào)控，在 LNCaP細(xì)胞中用shRNAs敲低HIF1?或HIF2?表達(dá)，然后低氧處理??h觀察PHF8表達(dá)變化。通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測HIF轉(zhuǎn)錄因子是否直接調(diào)控PHF8表達(dá)。第四，用免疫印跡實(shí)驗(yàn)比較常氧和低氧條件下PHF8底物H3K9me1, H3K9me2和H4K20me1的整體水平，同時(shí)在LNCaP和PC-3細(xì)胞中分析PHF8敲低對上述甲基化蛋白水平的影響。最后，我們用PHF8過表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LNCaP和PC-3細(xì)胞，用免

5、疫熒光染色分析常氧(21%O2)和低氧(1%O2)條件下PHF8過表達(dá)使組蛋白去甲基化的能力。第五，用免疫印跡和熒光定量PCR技術(shù)檢測了PHF8敲低對激素誘導(dǎo)的PSA和NKX3.1轉(zhuǎn)錄激活的影響。染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）用于分析在激素或去激素處理?xiàng)l件下 PHF8對AR的轉(zhuǎn)錄激活作用以及低氧條件下PHF8招募到PSA和NKX3.1啟動(dòng)子區(qū)域情況。第六，在293FT細(xì)胞中過表達(dá)GFP標(biāo)簽的AR和Flag標(biāo)簽的PHF8野生型或突變型質(zhì)粒；

6、在激素或去激素條件下處理24h，用GFP或Flag抗體實(shí)施免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。PHF8與 AR的內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)在 LNCaP細(xì)胞中進(jìn)行。最后，將4xUAS-TK-luc報(bào)告基因，Gal4 DNA綁定結(jié)構(gòu)域和AR(Gal-AR)，以及不同濃度梯度（照提示）的PHF8野生型或突變型（H247A）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測PHF8對AR的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　研究結(jié)果:
　　1. PHF8高表達(dá)與高的Glea

7、son分級和不良預(yù)后相關(guān)。在BPH到PIN再到高Gleason評分的前列腺癌患者組織中，PHF8表達(dá)呈逐漸上調(diào)的趨勢。相比于PHF8低表達(dá)組，PHF8高表達(dá)組包括更多Gleason評分8-10的低分化前列腺癌患者。低Gleason評分腫瘤中PHF8呈現(xiàn)更多胞質(zhì)染色，而在高Gleason評分腫瘤中 PHF8呈現(xiàn)更多胞核染色。PHF8在 BPH、激素敏感性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌組織中的表達(dá)也是與分化級別高度相關(guān)，在激素抵抗性前列腺癌組

8、織中能觀察到最高的PHF8表達(dá)水平。
　　2.前列腺癌PHF8高表達(dá)與去勢治療誘導(dǎo)的低氧相關(guān)。去勢治療減少了前列腺癌組織血流信號。同時(shí)在去勢治療后的臨床樣本中也觀察到HIF1α, HIF2α和PHF8分布于胞質(zhì)和胞核，并且呈高水平表達(dá)。
　　3.低氧誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PHF8高表達(dá)。三種前列腺癌細(xì)胞系LNCaP,22RV1和DU145分別低氧(1%O2)處理0,12和24h， PHF8蛋白和mRNA水平呈升高趨勢。敲低HIF1

9、α或HIF2α表達(dá)均降低了PHF8表達(dá)。HIF1?和HIF2?均能強(qiáng)烈誘導(dǎo)帶有-1281到+1長度PHF8啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告子轉(zhuǎn)錄激活。在低氧條件下，轉(zhuǎn)錄因子HIFs能綁定到PHF8的啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄。
　　4.低氧誘導(dǎo)的PHF8發(fā)揮去甲基化酶功能調(diào)節(jié)整體組蛋白甲基化水平。在LNCaP和293FT細(xì)胞中，低氧誘導(dǎo)PHF8表達(dá)并且導(dǎo)致PHF8底物H3K9me1, H3K9me2和 H4K20me1水平的下調(diào)，但沒有影響非 PH

10、F8底物 H3K9me3水平。在LNCaP和PC-3細(xì)胞中，敲低PHF8表達(dá)導(dǎo)致H3K9me1/2和H4K20me1水平的上調(diào)，但沒有增加H3K9me3表達(dá)。在常氧(21%O2)和低氧(1%O2)條件下，在LNCaP和PC-3細(xì)胞中過表達(dá)PHF8誘導(dǎo)了H3K9me1, H3K9me2和H4K20me1水平的下調(diào)，但沒有影響H3K9me3表達(dá)水平。
　　5. PHF8招募到AR靶基因調(diào)控其轉(zhuǎn)錄激活。在LNCaP和VCaP細(xì)胞中PHF

11、8敲低顯著減弱了DHT誘導(dǎo)的PSA和NKX3.1的轉(zhuǎn)錄激活。雖然與PSA和NKX3.1相比程度稍弱，PHF8敲低也顯著減弱了DHT誘導(dǎo)的AR的轉(zhuǎn)錄激活；同樣的結(jié)果也可以在去激素處理的22RV1細(xì)胞中觀察到。在激素作用下，PHF8可以招募到AR靶基因PSA和NKX3.1的啟動(dòng)子上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。
　　6. PHF8與AR相互作用轉(zhuǎn)錄激活A(yù)R是酶活性依賴性的。在293FT和LNCaP中分別檢測到外源性和內(nèi)源性PHF8和AR的相互作用。共表

12、達(dá)PHF8以劑量依賴方式增強(qiáng)AR轉(zhuǎn)錄活性。PHF8作為AR共刺激因子依賴于其去甲基化酶活性，因?yàn)樵赑HF8(H247A)突變型中沒有觀察到這種效應(yīng)。
　　研究結(jié)論：綜上所述，結(jié)果提示HIF/PHF8/AR信號軸的存在促進(jìn)了前列腺癌進(jìn)展。提出前列腺癌去勢治療誘導(dǎo)產(chǎn)生低氧微環(huán)境激活HIFs表達(dá)，而HIFs激活又促進(jìn)PHF8表達(dá)。PHF8上調(diào)增強(qiáng)AR轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展，其機(jī)制至少部分通過激活A(yù)R信號通路。研究提示HIF/PHF8