MYSM1在去勢抵抗性前列腺癌中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌是全世界男性癌癥死亡的最常見的原因之一。很多器官局限性前列腺癌患者在行根治性前列腺切除術或局部放療后腫瘤再次復發(fā)并進展。在分子水平上，雄激素激活雄激素受體（AR），作為核受體轉錄因子參與了特定致瘤基因的表達。因此，進展期的前列腺癌治療主要以抑制雄激素的合成和拮抗AR的雄激素剝奪療法為主。然而，大多數(shù)患者會對治療產生耐藥性，并隨后發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），在大多數(shù)情況下，CRPC仍然依賴于AR信號通路

2、。CRPC往往是致命的，故而改進對前列腺癌的治療顯得尤為迫切。AR如何調控CRPC生長并未完全闡釋清楚，但肯定是通過特定的機制使AR能夠在較低水平的雄激素下得以活化。
　　組蛋白泛素化是表觀遺傳修飾的重要形式之一，參與調控基因轉錄、細胞周期和DNA損傷修復等事件。MYSM1是組蛋白H2A特異性去泛素化酶，其N端的JAMM結構域是金屬酶共有的結構域，具有金屬蛋白酶的水解活性，能夠去除泛素分子。MYSM1的分子結構決定了它能夠在胞核內

3、去除泛素化的組蛋白，文獻和課題組前期工作證實MYSM1對造血干細胞和多種免疫細胞的發(fā)育及功能十分重要。雖然組蛋白泛素化修飾與腫瘤關系密切，但MYSM1在腫瘤中的作用尚無報道。研究表明，MYSM1參與了基因組穩(wěn)定性的維持及細胞增殖過程，這提示MYSM1可能在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。為探明MYSM1對腫瘤的作用及其機制，本課題擬驗證MYSM1與前列腺癌的相關性，明確其在前列腺癌發(fā)生中的作用，尋找并確定MYSM1的靶基因，探索MYSM1調控基

4、因轉錄的分子機制，從而為前列腺癌的診療和預后判斷提供潛在的靶點和標志物。
　　目的：
　　探討MYSM1在去勢抵抗性前列腺癌中的生物學作用及其機制。
　　方法：
　　1、利用公共數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas）中相關結果明確MYSM1在前列腺癌中的表達情況；
　　2、應用RNAi技術下調細胞內MYSM1的表達，通過qRT-PCR、Western blot對MYSM1表達水平進行鑒定；

5、
　　3、通過MTT實驗檢測下調MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細胞增殖的影響；
　　4、通過流式細胞儀分析下調MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細胞的細胞周期和細胞凋亡的影響；
　　5、通過劃痕實驗檢測下調MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細胞遷移能力的影響；
　　6、通過裸鼠皮下成瘤實驗檢測下調MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細胞體內成瘤能力的影響；
　　7、通過Co-IP方法證實MYSM1與AR的相互作用，通過C

6、hIP方法進一步驗證MYSM1的轉錄調控作用；
　　8、通過Western blot法檢測下調MYSM1對Akt/GSK-3β/C-Raf信號通路的影響。
　　結果：
　　1、MYSM1在前列腺癌中表達降低。
　　在公共數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas）中查找并分析MYSM1在前列腺癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)相較于正常前列腺組織，MYSM1在前列腺癌中表達降低，其表達水平與前列腺癌的惡性程度成

7、負相關。
　　2、MYSM1穩(wěn)定低表達細胞株及對照細胞株的建立。
　　用MYSM1的干擾慢病毒感染去勢抵抗性前列腺癌細胞（C4-2、22Rv1），應用嘌呤霉素持續(xù)篩選一周，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)視野內細胞綠色熒光皆為陽性；取篩選后的細胞，分別提取RNA及蛋白，通過qRT-PCR法檢測MYSM1的mRNA水平，Western blot法檢測MYSM1的蛋白表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾慢病毒能夠顯著下調MYSM1的m

8、RNA及蛋白表達水平。
　　3、MYSM1能夠明顯抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞的生長。
　　應用干擾慢病毒下調去勢抵抗性前列腺癌細胞（C4-2、22Rv1）中MYSM1的表達，進行一系列體內外功能實驗，結果發(fā)現(xiàn)：MTT實驗證實，下調MYSM1能夠顯著促進前列腺癌細胞的生長；流式細胞儀周期檢測結果顯示，下調MYSM1使G1期細胞減少，促進細胞周期進展；裸鼠皮下成瘤實驗顯示，下調MYSM1能夠顯著促進前列腺癌細胞體內成瘤能力；流式

9、細胞儀檢測細胞凋亡及劃痕實驗顯示，下調MYSM1對前列腺癌細胞凋亡及遷移能力并無顯著影響。
　　4、MYSM1能夠與AR相互作用，通過影響AR信號通路介導前列腺癌的生長。
　　有研究證實，MYSM1能夠協(xié)調組蛋白的乙?；c去泛素化進而參與基因的轉錄調控。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)MYSM1與AR的表達成正相關，但是，我們在細胞學水平證實，下調MYSM1并不影響AR的蛋白表達水平。下調MYSM1能夠促進AR下游靶基因的表

10、達，免疫共沉淀（Co-IP）實驗證實，MYSM1與AR存在相互作用，染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗進一步證實，MYSM1能夠調控雄激素反應元件（AREs）區(qū)域的染色質結構，從而影響AR信號通路相關分子的轉錄。
　　5、MYSM1能夠抑制Akt/GSK-3β/C-Raf信號通路，抑制前列腺癌的生長。
　　雄激素作用的發(fā)揮既可以通過經(jīng)典的雄激素受體介導的信號通路在核內轉錄調控雄激素反應元件；也可以經(jīng)由雄激素受體非依賴的信號通路

11、，通過活化PI3K/Akt信號通路從而參與腫瘤的生長。我們發(fā)現(xiàn)，MYSM1除了與AR直接結合影響經(jīng)典信的AR信號通路外，對非經(jīng)典的PI3K/Akt信號通路也有影響。下調MYSM1可以促進Akt、GSK-3β、C-Raf的磷酸化，同時，p53表達降低，c-Myc表達升高，激活Akt/GSK-3β/C-Raf信號通路，促進前列腺癌的生長。
　　結論：MYSM1作為一個重要的表觀遺傳分子，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其作用