藥物重定位策略在篩選去勢抵抗性前列腺癌藥物中的應用與研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　我國前列腺癌的發(fā)病率快速上升，而且中晚期患者比例較高，預后偏差。對于晚期前列腺癌患者，目前治療主要依賴于內(nèi)分泌治療，包括藥物去勢治療、抗雄激素治療、新一代雄激素生物合成抑制劑治療，可有效控制患者病情進展。但絕大多數(shù)患者仍會出現(xiàn)去勢抵抗，并伴有轉移。因此，利用現(xiàn)有去勢抵抗性前列腺癌的分子生物學研究基礎，繼續(xù)開發(fā)新型、有效的治療藥物，仍是該領域研究的的迫切任務。但是新藥研發(fā)依然面臨著研發(fā)周期長，人力、資金成本高、

2、成功概率低等困難。在新藥研發(fā)的多種不利因素的制約下，以及精準醫(yī)療對個性化用藥的迫切需求，藥物重定位(DrugReposition)策略，也稱作為老藥新用，即整合挖掘現(xiàn)已有的藥物未知的新用途，因其具有較高的投入產(chǎn)出效率，目前已經(jīng)成為目前抗癌藥物研發(fā)中的重要策略之一。公共數(shù)據(jù)庫CMap(Connectivity map，CMap)是目前較為完善基于藥物基因表達譜的藥物研究平臺，是藥物重定位研究中重要的工具之一。本課題的研究目的主要就是應用藥

3、物重定位策略，基于基因表達譜，篩選可治療去勢抵抗性前列腺癌藥物，并研究其作用機制。
　　實驗方法：
　　從NCBI網(wǎng)站的GEO免費共享數(shù)據(jù)庫下載涵蓋有激素敏感性前列腺癌原位病灶組織與去勢抵抗性前列腺癌骨轉移病灶組織基因表達譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE32269。利用R語言軟件，通過線性回歸和經(jīng)驗貝葉斯方法(limma)分析兩類組織的差異基因。并行GO分析和KEGG通路分析。隨后將差異基因轉換為探針號，導入CMap數(shù)據(jù)庫平臺，進行基因

4、表達譜比對、評分。我們挑選前列腺癌細胞系PC3的比對結果，以p≤0.05，enrichment≤-0.8，mean≤-0.6為藥物篩選標準，共篩選到9個候選藥物。結合CCK8細胞增殖實驗，以及藥物信息查詢（Drugbank，SuperTarget），確定候選藥物胍那芐。體外實驗，主要通過CCK8細胞增殖實驗，細胞克隆實驗，流式細胞儀檢測細胞凋亡，細胞劃痕實驗，transwell小室穿梭實驗（有或無matrigel覆蓋孔膜），wester

5、n blot實驗，RT-qPCR實驗，免疫組化，免疫熒光等明確胍那芐對去勢抵抗性前列腺癌有抑制細胞增殖、克隆形成，促進細胞凋亡，抑制細胞遷徙、侵襲等惡性生物學表型。在體外實驗中，我們構建穩(wěn)轉熒光素酶和mCherry熒光蛋白的PC3細胞，并主要通過構建基于PC3細胞的皮下移植瘤、脛骨平臺注射小鼠模型，并用游標卡尺監(jiān)測皮下移植瘤生長，應用活體成像儀檢測肺、脛骨部位腫瘤負荷。
　　實驗結果：
　　（一）第一部分
　　分析基因

6、表達譜數(shù)據(jù)集GSE32269，發(fā)現(xiàn)兩類組織的基因表達顯著差異，在去勢抵抗性前列腺癌骨轉移病灶組織中，其中有93個基因顯著上調(diào)表達，149個基因顯著下調(diào)表達。GO分析顯示，差異基因主要富集于細胞外區(qū)、結構分子活性、細胞粘附等。KEGG通路分析差異基因主要富集于細胞外基質互作，焦點粘附，谷胱甘肽代謝，氨基糖與核苷酸糖代謝。基因相應探針號導入CMap數(shù)據(jù)庫，進行基因表達譜比對、評分。我們挑選前列腺癌細胞系PC3的比對結果，以p≤0.05，en

7、richment≤-0.8，mean≤-0.6為藥物篩選標準，共篩選到9個候選藥物。
　?。ǘ┑诙糠?br>　　CCK8和克隆形成實驗表明胍那芐顯著抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞增殖、克隆形成，且為呈濃度依賴性抑制。AnnexinⅤ-FITC/PI標記雙標流式檢測表明胍那芐顯著促進去勢抵抗性前列腺癌細胞凋亡和周期阻滯。細胞劃痕實驗和transwell小室穿梭實驗表明，胍那芐可以抑制前列腺癌細胞遷移、侵襲能力。RT-qPCR，Wes

8、tern blot和免疫熒光實驗表明胍那芐還可明顯抑制前列腺癌細胞上皮間質化改變?；赑C3細胞的皮下移植瘤、脛骨平臺注射骨轉移裸鼠模型實驗表明，胍那芐可明顯抑制抑制瘤生長、轉移灶腫瘤負荷增長。
　?。ㄈ┑谌糠?br>　　RT-qPCR和Western blot實驗表明去勢抵抗性前列腺癌的GADD34的mRNA和蛋白水平表達均明顯高于雄激素依賴前列腺癌細胞以及正常前列腺上皮細胞。GADD34在去勢抵抗性前列腺癌細胞中的表達高于

9、雄激素依賴前列腺癌及正常前列腺癌上皮細胞。且胍那芐可以抑制p-eiF2α的脫磷酸化。當敲減GADD34時，去勢抵抗性前列腺癌細胞的增殖能力受到抑制，但與此同時，體外、體內(nèi)實驗都發(fā)現(xiàn)敲減GADD34后，腫瘤細胞對對胍那芐的敏感性也明顯所降低。
　　結論：
　?。ㄒ唬┤莸挚剐郧傲邢侔┹^激素敏感性前列腺癌基因表達有較大變化，基于該差異基因表達譜進行藥物重定位研究是可行、有效的。
　?。ǘ╇夷瞧S在體內(nèi)、體外顯著抑制前列腺癌