圍產(chǎn)期食物限制對(duì)大鼠神經(jīng)行為發(fā)育空間學(xué)習(xí)與記憶能力的影響.pdf

1、目的:
　　 成年和老年食物限制(food restriction,FR)可以產(chǎn)生許多有益的生物學(xué)效應(yīng),包括延長了生命周期、延緩衰老和疾病的進(jìn)程、提高學(xué)習(xí)和記憶能力及降低藥物的毒性等。然而,圍產(chǎn)期食物限制可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限(intrauterinegrowth restriction,IUGR),主要表現(xiàn)為新生兒出生后體重降低、生長緩慢、學(xué)習(xí)成績不良。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究表明,圍產(chǎn)期食物限制或營養(yǎng)不良除導(dǎo)致體重降低、生長緩慢外,還表

2、現(xiàn)為一些行為發(fā)育延遲及成年社會(huì)行為和空間學(xué)習(xí)能力下降等。由于圍產(chǎn)期營養(yǎng)不良對(duì)人類的生命和健康有極大危害,因此研究其對(duì)大鼠出生后神經(jīng)行為發(fā)育(發(fā)育轉(zhuǎn)折點(diǎn))及對(duì)認(rèn)知能力的影響有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)人類IUGR并為發(fā)展保護(hù)人類胎兒IUGR的策略提供有益的資料。本研究首先建立圍產(chǎn)期50％食物限制(FR50)Wistar大鼠模型,之后分別觀察圍產(chǎn)期FR50對(duì)新生期子代雌雄大鼠神經(jīng)行為發(fā)育(包括身體發(fā)育和神經(jīng)反射)的影響。由于新生期神經(jīng)行為發(fā)育的延遲或損

3、傷往往與后期(包括幼年和成年)的認(rèn)知行為下降有關(guān),因此又研究了子代成年雄性大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力、海馬CA1區(qū)突觸可塑性及海馬一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)陽性神經(jīng)元密度的變化,以揭示認(rèn)知行為變化的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分:圍產(chǎn)期50％食物限制大鼠模型的建立。為了研究圍產(chǎn)期營養(yǎng)不良對(duì)神經(jīng)行為發(fā)育和認(rèn)知能力的影響,需要有合適的動(dòng)物模型。通常有蛋白限制法和食物限制法。鑒

4、于前者在飼料制作方面困難,所以采用后者制作模型。根據(jù)食物限制的程度,通常又分為輕度(30％)、中度(50％)和重度(70％)食物限制法。本研究采用了中度食物限制法。健康成年(體重250-280 g)14周齡wistar雌鼠與雄鼠同籠(雌雄比2-3:1)。之后,每日早晨檢查雌鼠陰道口或陰道涂片,發(fā)現(xiàn)陰道栓或陰道涂片中有大量精子存在記為大鼠妊娠第0天(embryonic day0,E0),分籠喂養(yǎng)。將妊娠的雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=18)和模

5、型組(n=16)。對(duì)照組自由攝食,并記錄每日飼料消耗量。模型組從妊娠的E0到E6自由攝食,從妊娠的E7到仔鼠出生的21天(postnatal day21,PD21)進(jìn)行食物限制,食物限制量為對(duì)照組大鼠每日平均飼料消耗量的50％。兩組孕鼠均予充足飲水。分別于妊娠的E1、E7、E14和E21測(cè)定孕鼠體重。大鼠自然分娩,仔鼠出生的當(dāng)天記為PD0,分別于仔鼠出生的PD1、PD7、PD10、PD14和PD21稱重。發(fā)現(xiàn)FR50新生仔鼠體重明顯低于

6、正常組新生鼠,且孕鼠E14和E21體重也明顯低于正常組孕鼠。表明本實(shí)驗(yàn)方法模擬了圍產(chǎn)期營養(yǎng)不良狀態(tài),成功復(fù)制出胎鼠IUGR,有助于下一步研究新生子代大鼠神經(jīng)行為發(fā)育及圍產(chǎn)期營養(yǎng)不良狀態(tài)對(duì)認(rèn)知能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)第二部分:圍產(chǎn)期食物限制對(duì)子代新生Wistar大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響。以肛殖距判斷仔鼠的性別。典型的神經(jīng)行為發(fā)育評(píng)估包括身體生長和神經(jīng)反射兩部分。身體生長包括開耳(PD2-PD5)、睜眼(PD14-PD17)、門齒生長

7、(PD8-PDl2)和毛發(fā)出現(xiàn)(PD11-PD14)。神經(jīng)反射包括翻正反射(PD3-PD7)、負(fù)性趨地反射(PD6-PD10)和懸崖回避反射(PD4-PD9)。比較對(duì)照組和食物限制組新生仔鼠神經(jīng)發(fā)育的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)第三部分:圍產(chǎn)期食物限制對(duì)子代成年雄性大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力及海馬CA1區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)(10ng-term potentiation,LTP)的影響。大鼠出生后70天(PD70),運(yùn)用Morris水迷宮測(cè)試空間學(xué)習(xí)與

8、記憶能力。Morris水迷宮測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test)和空間探索(probe trial performance)兩個(gè)部分。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5天,每天分上下午兩個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練。在每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次,分別從4個(gè)坐標(biāo)象限的中點(diǎn)將大鼠面向池壁輕輕放入水中,記錄大鼠在120 s找到平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期(escape latency)。若在120 s內(nèi)找不到平臺(tái),則將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上并保持15 s。第6天

9、撤除平臺(tái)作空間探索實(shí)驗(yàn),選與平臺(tái)象限相對(duì)象限的中點(diǎn)為入水點(diǎn)將大鼠放入水中,記錄120 s內(nèi)大鼠跨越平臺(tái)的次數(shù)及在目標(biāo)象限的搜索時(shí)間百分比。之后,在海馬CA1區(qū)在體記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位(fEPSP)。單極記錄電極垂直插入海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突叢(前囟后3.4 mm,中線旁開2.5 mm),雙極刺激電極插入同側(cè)海馬Schaffer側(cè)枝(前囟后4.2 mm,中線旁開3.5 mm)。調(diào)整記錄電極及刺激電極深度,至記錄到最大場(chǎng)興奮性突觸后電位

10、(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)為止。海馬CA1區(qū)LTP區(qū)的記錄參數(shù)為:以波寬0.2ms、頻率0.033Hz的測(cè)試刺激,作用于大鼠海馬CA3區(qū)Schaffer側(cè)枝,誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突叢場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。以fEPSP幅度的50％電流強(qiáng)度作為最適刺激強(qiáng)度。記錄30 min f

11、EPSP后進(jìn)行高頻刺激。高頻刺激由10串200 Hz的方波組成,串間隔2 s。之后,用相同的波寬(頻率0.033Hz)記錄120 min fEPSP。
　　 實(shí)驗(yàn)第四部分:圍產(chǎn)期食物限制對(duì)子代成年雄性大鼠海馬神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)陽性細(xì)胞密度的影響。由于空間學(xué)習(xí)與記憶能力的變化及海馬CA1區(qū)LTP的誘導(dǎo)和維持需要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放。一氧化氮(nitr

12、ic oxide,NO)作為一種逆向信使,促進(jìn)突觸前神經(jīng)元谷氨酸的釋放,從而易化了在突觸后神經(jīng)元上記錄的LTP。因此,進(jìn)一步用免疫組化方法觀察海馬三個(gè)亞區(qū)nNOS陽性細(xì)胞的密度。以期從一氧化氮的角度研究圍產(chǎn)期食物限制消弱了子代空間學(xué)習(xí)和記憶能力的機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1)圍產(chǎn)期食物限制導(dǎo)致新生雌雄大鼠身體生長延遲,包括開耳、門齒生長、毛發(fā)和睜眼延遲。
　　 2)圍產(chǎn)期食物限制導(dǎo)致雌雄新生大鼠神經(jīng)反射延遲,包

13、括翻正反射和:懸崖回避反射。另外,食物限制還導(dǎo)致雄性新生大鼠負(fù)性趨地反射延遲,但不影響雌性新生大鼠負(fù)性趨地反射。
　　 3)圍產(chǎn)期食物限制導(dǎo)致成年雄性子代大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力下降。
　　 4)圍產(chǎn)期食物限制導(dǎo)致成年雄性子代大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性降低。
　　 5)圍產(chǎn)期食物限制降低了海馬三個(gè)亞區(qū)(CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回)nNOS陽性細(xì)胞的密度。
　　 結(jié)論:
　　 1)圍產(chǎn)期食物限制導(dǎo)致新