低溫、手術創(chuàng)傷對大鼠空間學習記憶能力的影響.pdf

1、前言
　　 Tau蛋白是一種具有生理功能的可溶性蛋白,能夠與微管蛋白結合,在神經元及軸突的生長過程中起著重要作用。二十世紀80年代最早有報道描述了tau蛋白,后來不斷發(fā)現(xiàn)tau蛋白還有高度磷酸化和神經纖維纏結(neurofibrillary tangles(NFTs))的形式存在。在以后20年里,NFT被認為是神經退行性變的病理基礎。但是,許多研究中發(fā)現(xiàn),NFT形成之前的高度磷酸化tau蛋白的聚集同樣導致記憶紊亂,利用轉基因鼠的

2、研究也提示,其空間記憶的損害與tau病理有關。全身麻醉藥能夠明顯地損害正常的體溫調節(jié),導致圍手術期低溫。有關圍手術期低溫引起的生化改變,以及對tau病理和學習記憶的影響卻知之甚少。已有研究報道了麻醉對鼠腦tau蛋白磷酸化的影響,發(fā)現(xiàn)并非麻醉本身,而是繼發(fā)于麻醉的低溫抑制了磷酸酶活性,從而導致tau蛋白磷酸化。
　　 近些年,術后認知功能障礙逐漸成為研究熱點,但是,對于體內有關炎性反應影響tau病理,從而引發(fā)學習記憶改變的研究并不

3、多見。關于炎性因子對嚙齒類認知功能的影響的研究提示,對于老年鼠,小手術即可以引發(fā)夸大的神經炎性反應,但并不損害其Morris水迷宮的測試能力,另一研究提示,手術引發(fā)了大鼠短暫的認知下降,并且伴隨有短暫的海馬內膠質細胞的激活和促炎性因子的釋放。
　　 糖原合酶-3β(glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)是AD大腦中神經纖維纏結形成之前的一個重要的磷酸化tau蛋白的激酶。GSK-3β能夠促進小

4、膠質細胞對炎癥的反應,而利用其抑制劑可以局限這種反應。在人類包涵體肌炎的細胞中,利用氯化鋰抑制GSK-3β的活性可以減輕tau蛋白的磷酸化,GSK-3β和tau蛋白的共同定位,進一步說明GSK-3β在tau病理中的作用。因此,我們探究了手術創(chuàng)傷引發(fā)的免疫反應是否增加神經炎性反應和認知損害,而且,我們更關注于炎性因子是否通過GSK-3β介導tau病理。
　　 雖然低溫可能對危重病人有利,但是圍手術期由麻醉帶來的低溫對大多數病人是有

5、害的。低溫雖然沒有引起明顯的神經損害,但是可能帶來認知功能障礙。本研究旨在利用Y-迷宮對大鼠工作記憶和參考記憶進行測試,探討暴露于臨床相關濃度的異氟烷是否導致tau蛋白高度磷酸化以及是否帶來記憶損害。同時,我們測試了給與或不給予氯化鋰處理的脾切除鼠的空間記憶能力,試圖揭示圍手術期低溫以及炎性因子對術后認知功能的影響機制。
　　 材料和方法
　　 雄性成年SD大鼠購于中國醫(yī)科大學動物實驗中心,6月齡,體重350-400g,

6、動物在22-23℃環(huán)境中自由活動,12:12小時日夜循環(huán),自由進食水。大鼠吸入異氟烷麻醉誘導后氣管插管,機械通氣維持異氟烷濃度為1.3％-1.5％,期間監(jiān)測大鼠心電圖及直腸溫。
　　 實驗一:大鼠隨機分為三組:健康對照組(group A；n=15)無任何干預措施。麻醉保溫組(group B；n=60),大鼠異氟烷麻醉后利用加溫摯保持體溫在36.0-37.0℃。麻醉低溫組(group C；n=60),大鼠麻醉后暴露于22℃室溫。麻

7、醉后大鼠自然蘇醒分籠飼養(yǎng)。B,C組大鼠分別于2h麻醉后即刻,麻醉后1,3,7天(15只/時點)處死,標記為B0,B1,B3,B7,C0,C1,C3,和C7。
　　 實驗二:大鼠隨機分為三組:健康對照組(group A；n=15)無任何干預措施。手術保溫組(group B；n=45),大鼠異氟烷麻醉后利用加溫墊保持體溫在36.0-37.0℃,行脾切除。手術低溫組(group C；n=45),大鼠麻醉后暴露于22℃室溫行脾切除。B,

8、C,組所有動物均麻醉2小時,B,C組手術后1,3,7天處死(15只/時點)。B,C組動物每個時點標記為B1,B3,B7,C1,C3和C7。
　　 實驗三:大鼠隨機分為三組:健康對照組(group A；n=15)無任何干預措施。手術和氯化鈉組(group C；n=45),異氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化鈉。手術和氯化鋰組(group D；n=45),異氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化鋰。B,C組所有動物均麻醉2小時,期間保持體溫36

9、-37℃,B,D組手術后1,3,7天處死(15只/時點)。B,C組動物每個時點標記為B1,B3,B7,C1,C3和C7。
　　 利用Y-迷宮電刺激儀測試大鼠空間學習和記憶能力。免疫組織化學方法定位磷酸化tau蛋白,total tau蛋白以及GSK-3β表達。蛋白印跡分析方法檢測磷酸化tau蛋白,total tau蛋白,IL-1β蛋白,TNF-α蛋白以及GSK-3β表達變化。利用絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶測定系統(tǒng)進行蛋白磷酸酶2A(PP

10、2A)活性測定。實時定量PCR分析IL-1βmRNA和TNF-αmRNA變化。
　　 實驗數據統(tǒng)計為均數±標準差。利用SPSS13.0軟件分析,同組間參數分析利用t檢驗,不同組間參數比較利用單因素或多因素方差分析,后繼Dunnett檢驗,P<0.05認為有顯著性差異。
　　 結 果
　　 實驗一:異氟烷麻醉后2h誘發(fā)低體溫,大鼠直腸溫度可以最低下降到26.0℃。麻醉期間的低溫誘發(fā)麻醉后1天工作記憶的短暫損害。室溫

11、下暴露于異氟烷誘發(fā)大鼠腦內tau蛋白磷酸化,Thr205位點和Ser396位點與對照組比較分別增加了10倍和2.9倍,但total tau沒有顯著變化。高度磷酸化。Thr-205和total tau抗體雙染表達定位于海馬CA1區(qū)。當麻醉鼠進行保溫處理時,磷酸化位點恢復到對照組水平。麻醉誘發(fā)的低溫抑制大鼠腦內PP2A活性下降45％,保溫后活性恢復。
　　 實驗二:麻醉后低溫接受手術大鼠,術后1,3天工作記憶短暫損害。麻醉后保溫接受

12、手術大鼠,術后3天工作記憶短暫損害。手術后3天大鼠腦內tau蛋白Thr205位點和Ser396位點磷酸化與對照組比較分別增加了2.7倍和1.1倍,但totaltau沒有顯著變化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗體雙染表達定位于海馬CA1區(qū)。與對照組比較,術后第1,3天手術保溫組IL-1βmRNA分別增加1.6倍和60％,手術低溫組增加17.3倍和1.6倍。術后1天手術保溫組和低溫組TNF-αmRNA的表達分別增加0.32和1倍,

13、第3天低溫組TNF-αmRNA的表達增加0.6倍。術后1天,保溫組和低溫組IL-1β蛋白表達分別增加0.73和1.35倍。TNF-α蛋白表達沒有顯著變化。在手術組大鼠,GSK-3β激活,表現(xiàn)為無活性狀態(tài)的磷酸化GSK-3β的保溫組和低溫組分別降低55％和53％,而GSK-3β總體水平沒有變化。
　　 實驗三:手術后接受氯化鈉處理的大鼠,術后3天測試工作記憶短暫損害。手術后接受氯化鋰處理的大鼠,術后工作記憶與對照組沒有明顯差異。手

14、術創(chuàng)傷使氯化鈉組大鼠術后3天腦內tau蛋白Thr205位點和Ser396位點磷酸化與對照組比較分別增加了2.7倍和1.2倍,但total tau沒有顯著變化。給與氯化鋰干預后tau蛋白與對照組沒有明顯變化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗體雙染表達定位于海馬CA1區(qū)。與對照組比較,術后第1,3天氯化鈉組IL-1βmRNA分別增加1.5和0.5倍,氯化鋰組增加1.4倍和50％(P<0.01)。術后1天,氯化鈉組和氯化鋰組IL-3β

15、蛋白表達分別增加0.9和0.67倍。術后第1天兩組TNF-αmRNA的表達均增加0.23倍。TNF-α蛋白表達沒有顯著變化。在氯化鈉組,GSK-3β激活,表現(xiàn)為無活性狀態(tài)的磷酸化GSK-3β降低55％,而GSK-3β總體水平沒有變化。氯化鋰組磷酸化GSK-3β與對照組沒有顯著差異。
　　 結論
　　 1、異氟烷麻醉后可以導致持久的低溫,tau蛋白磷酸化并非麻醉本身所致,而是麻醉誘發(fā)的低溫對磷酸酶活性的抑制,從而引起tau