Foxp3和HO-1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎病程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及依達(dá)拉奉保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+Tregs)和HO-1在EAE病程中的相關(guān)性,以及依達(dá)拉奉對EAE的保護(hù)作用,進(jìn)一步確立依達(dá)拉奉對MS的治療效應(yīng)。
　　 方法:本研究采用脊髓/鹽水(W/V)=1:10的小劑量豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)/完全福氏佐劑(CFA)的方法免疫Wistar大鼠制備EAE模型,應(yīng)用依達(dá)拉奉注射液進(jìn)行干預(yù)。將171只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、EA

2、E組和依達(dá)拉奉組三個(gè)組。依達(dá)拉奉組免疫方法與EAE組相同,于免疫當(dāng)天起給予依達(dá)拉奉注射液10mg·kd-1·d-1腹部內(nèi)注射至處死,對照組用生理鹽水/CFA免疫動(dòng)物。EAE組和對照組每天給予生理鹽水1ml/大鼠腹腔內(nèi)注射作為對照。觀察藥物對EAE大鼠發(fā)病的影響,參照通用的臨床評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。于免疫后第10天各組隨機(jī)取材,記為發(fā)病前組,并取發(fā)病3天和發(fā)病7天的大鼠,記為3天組(高峰期)和7天組(緩解期)。取大鼠脊髓腰膨大部

3、位的組織進(jìn)行臟染色觀察炎癥情況,同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察Foxp3和HO-1陽性細(xì)胞的分布并計(jì)數(shù)。用實(shí)時(shí)定量PCR法測定大鼠脊髓腰膨大組織和胸腺組織中Foxp3和HO-1mRNA的含量。取大鼠尾靜脈血,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中的IL-10和TGF-β的濃度值。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)病率用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示,多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOV

4、A方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,相關(guān)性檢驗(yàn)采用Linear Correlation,P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、動(dòng)物發(fā)病情況的觀察:依達(dá)拉奉組平均起病時(shí)間為(17.33±2.09)天,較EAE組顯著延遲;發(fā)病率為46.8％,顯著低于EAE組(80.4％),神經(jīng)功能評分顯著低于EAE組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、組織病理學(xué)改變(脊髓腰膨大部位):

5、　　 (1)發(fā)病前 EAE組可見散在炎性細(xì)胞浸潤,依達(dá)拉奉組沒有炎性細(xì)胞浸潤。
　　 (2)發(fā)病后第3天 EAE組可見炎性細(xì)胞彌漫性浸潤和大量“血管袖套”形成,依達(dá)拉奉組“血管袖套”形成較少,炎性細(xì)胞主要集中于小血管周圍。
　　 (3)發(fā)病后第7天 EAE組炎性細(xì)胞和“血管袖套”減少,依達(dá)拉奉組炎性細(xì)胞更少,“血管袖套”消失。
　　 (4)空白對照組各時(shí)期均沒有炎性細(xì)胞浸潤和“血管袖套”形成。
　　 3

6、、脊髓Foxp3和HO-1的表達(dá):
　　 Foxp3在炎性細(xì)胞上呈陽性表達(dá),HO-1在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞上均有陽性表達(dá),本研究主要計(jì)數(shù)和比較表達(dá)Foxp3、HO-1的炎性細(xì)胞。
　　 (1)空白對照組兩種因子不同時(shí)期的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (2)發(fā)病前 EAE組Foxp3免疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(20.57±3.31),HO-1平均數(shù)目為(19.28±3.56);依達(dá)拉奉組Foxp3免

7、疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(26.78±4.02),HO-1平均數(shù)目為(29.26±3.86),兩者均顯著高于EAE組;兩組均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)發(fā)病后第3天 EAE組Foxp3免疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(23.60±2.78),HO-1平均數(shù)目為(37.03±3.68);依達(dá)拉奉組Foxp3免疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(44.05±2.68),HO-1平均數(shù)目為(50.50±3.67),

8、均顯著高于EAE組;兩組兩種因子的免疫陽性細(xì)胞的平均數(shù)目均較發(fā)病前顯著增加;且均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)發(fā)病后第7天 EAE組Foxp3免疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(27.86±2.88),HO-1平均數(shù)目為(41.73±4.41),均較發(fā)病后第3天顯著增加;依達(dá)拉奉組Foxp3免疫陽性細(xì)胞平均數(shù)目為(33.36±3.19),HO-1平均數(shù)目為(45.82±3.71),均較發(fā)病后第3

9、天明顯減少;依達(dá)拉奉組顯著高于EAE組,兩組均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、脊髓和胸腺中Foxp3和HO-1 mRNA的含量:
　　 4.1脊髓:
　　 (1)發(fā)病前 EAE組Foxp3的平均RQ值為(0.213±0.060),HO-1的平均RQ值為(0.346±0.020);依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(1.142±0.027),HO-1的平均RQ值為(1.35

10、3±0.034),均顯著高于EAE組;兩組兩種因子的平均RQ值均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)發(fā)病后第3天 EAE組Foxp3的平均RQ值為(1.058±0.031),HO-1的平均RQ值為(1.446±0.025),兩者均較發(fā)病前顯著增加;依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(3.650±0.031),HO-1的平均RQ值為(4.444±0.024),均顯著高于EAE組,且均較發(fā)病前

11、顯著增加;兩組兩種因子的平均RQ值均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)發(fā)病后第7天 EAE組Foxp3的平均RQ值為(2.894±0.068),HO-1的平均RQ值為(3.058±0.031),兩者均較發(fā)病后第3天顯著增加;依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(3.585±0.053),HO-1的平均RQ值為(3.861±0.020),兩者均較發(fā)病后第3天顯著減少,且兩者均顯著高于EAE組

12、;兩組兩種因子的平均RQ值均顯著高于空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)空白對照組兩種因子各時(shí)期的平均RQ值均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.2胸腺:
　　 (1)發(fā)病前 EAE組Foxp3的平均RQ值為(1.853±0.030),HO-1的平均RQ值為(0.551±0.035),均顯著小于對照組的平均RQ值;依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(3.451±0.027)

13、,HO-1的平均RQ值為(0.957±0.021),均顯著大于EAE組和空白對照組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)發(fā)病后第3天 EAE組Foxp3的平均RQ值為(3.553±0.029),HO-1的平均RQ值為(1.556±0.025);依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(4.446±0.024),HO-1的平均RQ值為(2.165±0.021),均顯著高于EAE組;兩組兩種因子的平均RQ值均顯著大于空

14、白對照組,且均較發(fā)病前顯著增加,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)發(fā)病后第7天 EAE組Foxp3的平均RQ值為(1.856±0.021),HO-1的平均RQ值為(0.545±0.024),均顯著小于同時(shí)期空白對照組的平均RQ值;依達(dá)拉奉組Foxp3的平均RQ值為(4.348±0.035),HO-1的平均RQ值為(1.255±0.025),均顯著高于空白對照組和EAE組;兩組兩種因子的平均RQ值均較發(fā)病后第

15、3天顯著減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)空白對照組兩因子各時(shí)期的平均RQ值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、相關(guān)性檢驗(yàn):在同組同時(shí)期內(nèi)脊髓中Foxp3和HO-1的免疫陽性細(xì)胞數(shù)目以及脊髓和胸腺中Foxp3和HO-1 mRNA的含量呈正相關(guān)(P＜0.05,r＞0)。
　　 6、外周血IL-10和TGF-β的濃度
　　 (1)發(fā)病前 EAE組IL-10的平均濃度為(17.7

16、2±0.23),TGF-β的平均濃度為(80.64±0.21),均顯著低于空白對照組;依達(dá)拉奉組IL-10的平均濃度為(19.39±0.21),TGF-β的平均濃度為(86.59±0.21),均顯著高于EAE組和空白對照組;以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)發(fā)病后第3天 EAE組IL-10的平均濃度為(20.39±0.28),TGF-β的平均濃度為(86.52±0.26);依達(dá)拉奉組IL-10的平均濃度為(2

17、1.43±0.27),TGF-β的平均濃度為(88.42±0.33),均顯著高于EAE組;兩組兩種因子均顯著高于空白對照組,且均較發(fā)病前顯著增加;以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)發(fā)病后第7天 EAE組IL-10的平均濃度為(17.40±0.24),TGF-β的平均濃度為(80.77±0.19),均顯著低于同時(shí)期空白對照組;依達(dá)拉奉組IL-10的平均濃度為(20.45±0.36),TGF-β的平均濃度為(87

18、.42±0.29),均顯著高于同時(shí)期空白對照組和EAE組;兩組兩種因子的平均濃度均較發(fā)病后第3天顯著減少;以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)空白對照組兩種因子各時(shí)期的平均濃度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、依達(dá)拉奉可以延遲EAE的起病時(shí)間,降低發(fā)病率,減輕神經(jīng)功能損傷的程度。
　　 2、EAE組大鼠脊髓中Foxp3和HO-1的免疫陽性細(xì)胞數(shù)目和mRNA含量隨病

19、程逐漸遞增,提示兩種因子隨病程變化而上調(diào)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用;依達(dá)拉奉治療后,兩種因子在同時(shí)期表達(dá)及mRNA含量均較EAE組增高,說明依達(dá)拉奉能促進(jìn)Foxp3和HO-1的表達(dá)和更新,對疾病具有治療作用。
　　 3、EAE大鼠胸腺中Foxp3和HO-1的mRNA含量在病程高峰期升高,發(fā)病前期和恢復(fù)期均低于正常,提示胸腺產(chǎn)生的CD4+CD25+Foxp3+Tregs(nTregs)和HO-1更新減低導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力下降可

20、能是EAE發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要因素。依達(dá)拉奉治療后兩因子mRNA含量較同時(shí)期EAE組顯著增加并高于空白對照組,提示依達(dá)拉奉能促進(jìn)nTregs和HO-1的更新,對疾病具有治療作用。
　　 4、脊髓中Foxp3和HO-1的免疫陽性細(xì)胞數(shù)目以及脊髓和胸腺中Foxp3和HO-1的mRNA含量具有正相關(guān)性,提示EAE病程中HO-1的變化主要與表達(dá)HO-1的CD4+CD25+Foxp3+Tregs隨疾病進(jìn)展而發(fā)生變化有關(guān),HO-1與Foxp3具