胃腺癌中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞克隆性起源及臨床病理意義的研究.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一.普通型胃腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化，是指胃腺癌中出現(xiàn)分化的神經(jīng)內(nèi)分泌(NE)細(xì)胞，但其數(shù)目在癌組織成分中所占比例較小，不足50％，并且這些分化的NE細(xì)胞多以單個(gè)或者細(xì)胞巢的形式分散存在。我們以往的研究結(jié)果顯示，大腸腺癌、胃腺癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中NE細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)率分別為41.5％，39.6％，38.1％，21％和17.9％，并發(fā)現(xiàn)在大腸癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中，高分化腺癌NE細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)率明

2、顯高于低分化腺癌，而胃癌則相反，低分化腺癌中NE細(xì)胞的發(fā)生現(xiàn)率明顯高于高分化腺癌。這些差異性是否與腫瘤所在部位的胚胎起源、腫瘤病因?qū)W、組織發(fā)生學(xué)的不同及遺傳學(xué)改變有關(guān)，仍處于探索研究階段。因此，通過分子生物學(xué)的方法認(rèn)識(shí)NE細(xì)胞的性質(zhì)，有助于更深入的認(rèn)識(shí)胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理，并為臨床診斷和治療提供依據(jù)。目前國內(nèi)外對(duì)非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中NE細(xì)胞的研究較少，特別是用分子遺傳學(xué)方法研究普通型胃腺癌中單個(gè)NE細(xì)胞的起源方面尚未見報(bào)道。關(guān)于胃腺癌中N

3、E分化的發(fā)生機(jī)制存在許多不同的假說，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NE細(xì)胞和上皮細(xì)胞均來源于內(nèi)胚層多潛能干細(xì)胞。在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)過程中，內(nèi)胚層的多潛能干細(xì)胞受激素、局部微環(huán)境及基因組不穩(wěn)定性的影響，使某些被抑制的基因組密碼發(fā)生隨機(jī)脫抑制，在RNA水平選擇性激活兩種以上調(diào)節(jié)機(jī)制，最終導(dǎo)致基因產(chǎn)生雙向或多向分化。然而，這些推測僅建立在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)之上，缺乏可靠性。這些散在的NE細(xì)胞是否存在基因水平的改變，它們是腫瘤的實(shí)質(zhì)成分，還是僅僅作為腫瘤的間質(zhì)成分存

4、在，尚無明確定論。激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)可以使研究者可以獲得形態(tài)完整的單一細(xì)胞或細(xì)胞群進(jìn)行遺傳學(xué)研究，解決了目的細(xì)胞的捕獲難題。由于該技術(shù)在切除和提取細(xì)胞過程中不產(chǎn)生熱量，對(duì)目的細(xì)胞沒有任何損傷，即避免了鄰近細(xì)胞的污染，又不會(huì)損傷DNA、RNA。目前國際上很多研究，其樣本的獲取都是利用了LCM技術(shù)。DNAMicro-kit試劑盒可以對(duì)微量組織或LCM捕獲的細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提，聯(lián)合應(yīng)用Repli-g擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，可以

5、獲得足量DNA用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。野生型p53(wt-p53)作為抑癌基因，在正常組織中參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程，發(fā)生突變或缺失時(shí)，將喪失上述功能，使細(xì)胞增殖失控，凋亡受阻，從而引發(fā)腫瘤。錯(cuò)配修復(fù)功能的完整是細(xì)胞DNA準(zhǔn)確復(fù)制和基因組穩(wěn)定的基本保證。該功能缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MLH1基因是錯(cuò)配修復(fù)基因家族的重要成員之一，具有修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配，增強(qiáng)DNA復(fù)制忠實(shí)性，維持基因組穩(wěn)定性降低自發(fā)性突變的功能。E-c

6、adherin(上皮型鈣粘蛋白)是一種介導(dǎo)同種細(xì)胞相互黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，對(duì)細(xì)胞極性的建立，維持上皮細(xì)胞正常形態(tài)至關(guān)重要。抑癌基因PTEN在正常組織中參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間相互作用及抑制血管生成等過程。當(dāng)PTEN發(fā)生突變或缺失時(shí)，將喪失上述功能，不但減少對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，還可以促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖。干細(xì)胞在分化過程中，染色體有絲分裂不均衡，可造成部分基因在兩種分化的細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)等

7、位基因的改變(如增益、丟失、突變等)，通過對(duì)微衛(wèi)星改變(包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失)及突變、CGH等的檢測可推測組織細(xì)胞的克隆性來源。
　　 目的：在全基因組范圍內(nèi)選取多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，聯(lián)合p53突變檢測，對(duì)普通型胃腺癌NE細(xì)胞進(jìn)行分子水平上的研究，以期明確NE細(xì)胞的克隆性起源。制備了組織芯片，聯(lián)合應(yīng)用免疫組化方法檢測CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN等5個(gè)指標(biāo)在胃癌中的表達(dá)情況，結(jié)合隨訪資料，綜合分析上述

8、指標(biāo)的表達(dá)與伴有NE分化胃癌的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的診斷及預(yù)后評(píng)估提供理論指導(dǎo)。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)收集浙江省人民醫(yī)院2001-2003年間胃腺癌及正常胃粘膜新鮮標(biāo)本120例。首先用冰凍切片-嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A，CgA)免疫組化方法對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行初篩，確定含NE細(xì)胞較多的組織，經(jīng)紅外線激光捕獲顯微切割獲取500個(gè)左右單個(gè)NE細(xì)胞，應(yīng)用DNA Micro-kit抽提試劑盒及Repli-g全基因組

9、擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行DNA抽提和全基因組放大，全基因組范圍內(nèi)選取26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合PCR-SSCP-銀染色檢測NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞微衛(wèi)星改變情況，聯(lián)合PCR-測序檢測基因p53突變發(fā)生情況，推測胃腺癌中NE細(xì)胞的克隆性起源。收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和紹興市人民醫(yī)院手術(shù)切除胃癌標(biāo)本共220例，另取31例同期非腫瘤胃黏膜組織作為對(duì)照。制備組織芯片，聯(lián)合應(yīng)用免疫組化檢測CGA、p53、MLHI、E-cadherin、PTEN等5個(gè)指標(biāo)在胃癌

10、中的表達(dá)情況，結(jié)合隨訪資料，綜合分析上述指標(biāo)的表達(dá)與伴有NE分化胃癌的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果：⑴免疫組化-激光捕獲顯微切割：120例胃腺癌新鮮組織中，含有中-大量NE細(xì)胞的占25.0％(30/120)，在20倍物鏡下捕獲腺癌中單個(gè)NE細(xì)胞500個(gè)左右。⑵微衛(wèi)星分析結(jié)果：30例樣本中MSI總發(fā)生率為27.4％，LOH總發(fā)生率為17.9％，各樣本MSI發(fā)生率高于LOH。從不同細(xì)胞微衛(wèi)星改變發(fā)生率比較，NE細(xì)胞與腺癌細(xì)

11、胞發(fā)生率無明顯差異。各樣本MSI及LOH發(fā)生率與胃癌的臨床病理參數(shù)之間無明顯相關(guān)性。從兩種細(xì)胞LOH及MSI一致性來看，例2、3、5、6，11、12、18、24、27、30在NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞中發(fā)生了完全一致的微衛(wèi)星改變，其余樣本除例7和10外，其他18例微衛(wèi)星改變的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶p53突變結(jié)果：30例樣本中NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞p53突變主要集中在外顯子7和8，從p53突變的一致性上看，樣本4、14、21、27的NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞均

12、發(fā)生了外顯子7、8的一致性突變，例7的兩種細(xì)胞突變不一致，例17僅腺癌細(xì)胞發(fā)生了突變。腺癌細(xì)胞p53突變有6例(20.O％)，NE細(xì)胞p53突變有5例(16.7％)。臨床病理資料顯示多為浸潤性低分化腺癌，TNM分期為in-rv期。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示p53突變與胃腺癌分化程度、TNM分期、血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。⑷結(jié)合微衛(wèi)星改變及基因突變結(jié)果，30例伴NE分化的普通型胃腺癌中，27例NE細(xì)胞與腺癌細(xì)胞起源于同一千細(xì)胞，NE細(xì)

13、胞作為腫瘤成分，本身具惡性且分泌激素促進(jìn)腫瘤生長。其余3例微衛(wèi)星改變及基因突變不一致，可能是激素或微環(huán)境作用的結(jié)果，有待于進(jìn)一步研究。⑸胃癌中CGA蛋白表達(dá)率為47.7％，其表達(dá)與胃癌分化程度相關(guān)，低、未分化組的陽性率較高。在p53陽性組中NE分化占46.5％，且NE分化與胃癌浸潤深度呈正相關(guān)，與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，CGA陽性表達(dá)患者的預(yù)后較差。⑹p53蛋白在胃癌中的表達(dá)率為45.0％，明顯高于正常對(duì)照組，其表達(dá)與胃癌TNM分期、浸

14、潤深度呈正相關(guān)。在NE分化胃癌中，p53蛋白表達(dá)與浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。生存分析顯示，陽性表達(dá)患者預(yù)后差。⑺在胃癌中E-cadherin蛋白陽性率為為15.5％，低于正常胃粘膜表達(dá)率，其陽性表達(dá)與TNM分期及脈管侵犯呈負(fù)相關(guān)，陽性表達(dá)患者的生存率顯著高于陰性者。⑻MLH1蛋白在胃癌中的陽性表達(dá)率為15.9％，較正常對(duì)照組低。MLH1蛋白在NE細(xì)胞陽性組胃癌中的表達(dá)與TNM分期呈負(fù)相關(guān)，生存分析顯示，陽性表達(dá)患者有較好的預(yù)后。⑼PT