普通型胃腺癌中神經內分泌細胞克隆性起源的研究.pdf

1、普通型胃腺癌伴神經內分泌(neuroendocrine，NE)分化，是指胃腺癌中有分化的神經內分泌細胞，但其數(shù)目在癌組織成分中所占的比例較小不足50％，且以單個細胞或細胞巢的形式分散存在，是彌漫神經內分泌系統(tǒng)的一部分。我們以往研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌伴散在NE細胞分化約占38.1％，大腸癌和乳腺癌分別為41.5％和21％，且高分化癌NE細胞的發(fā)現(xiàn)率明顯高于低分化癌。而普通型胃腺癌中，NE細胞分化約占39.6％，低分化腺癌明顯高于高分化腺癌。這些

2、差異是否與腫瘤所在部位的胚胎起源、腫瘤病因學、組織發(fā)生學的不同及遺傳學改變有關，仍處于探索研究階段。 與神經內分泌腫瘤相比，非神經內分泌腫瘤中NE細胞研究較少，特別是用分子遺傳學方法研究普通型胃腺癌中單個NE細胞的起源方面尚未見報道。關于普通腺癌伴NE分化的發(fā)生機制存在許多不同的假說。目前多數(shù)人認為NE細胞和上皮細胞均來源于內胚層多潛能干細胞。在腫瘤發(fā)生及演進過程中，內胚層的多能干細胞受激素、局部微環(huán)境及基因組不穩(wěn)定性的影響，使

3、某些被抑制的基因組密碼發(fā)生隨機脫抑制，在RNA翻譯水平選擇性的激活兩種以上的調節(jié)基因產生雙向或多向分化。然而，這些推測僅建立在形態(tài)學的觀察及體外實驗的基礎上，缺乏可靠性和再現(xiàn)性；且不同腫瘤組織中散在的NE細胞不論在形態(tài)上還是對腫瘤組織的生物學行為的影響上都存在很大區(qū)別，究竟散在的神經內分泌細胞是否存在染色體及相關基因水平的改變，它們是否為腫瘤的一種成分，尚不清楚。因此，我們對伴神經內分泌分化的普通型胃腺癌進行分子水平的研究，以期明確NE

4、細胞的克隆性起源，對這一類型的胃腸道腫瘤做出新的評價。 激光顯微切割技術的出現(xiàn)，使得我們能夠從胃腺癌中獲取單個散在的NE細胞。全基因組擴增技術是一項以微量(ng級)DNA為模板，通過Phi29DNA聚合酶強大的結合能力及3’-5’外切酶活性對全基因組進行高保真性地連續(xù)擴增，從而得到大量(μg級)基因組DNA的新技術，它彌補了模板量不足的問題。聯(lián)合激光顯微切割及全基因組放大，獲取腺癌中NE細胞，提取DNA并與腺癌細胞進行分子水平改

5、變的比較，在全基因組范圍內尋找復制差異片段，推測其克隆起源。 干細胞在分化過程中，染色體有絲分裂不均衡，可造成部分基因在兩種分化的細胞中同時出現(xiàn)等位基因的改變(增益、丟失或突變)，此原理可以通過微衛(wèi)星改變(包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失)及突變、CGH等方法推斷組織細胞的克隆性起源。微衛(wèi)星不穩(wěn)定及雜合性丟失已成為較成熟的推斷腫瘤起源的方法，它具有敏感性強的特點，但由于各實驗室選擇微衛(wèi)星位點的差異較大，尚缺乏特異性?；虻耐蛔兺瑯涌?/p>

6、以推測腫瘤起源，具有較高的特異性但敏感性不強。聯(lián)合微衛(wèi)星和突變的檢測可以使推理結果更準確。 材料和方法本實驗收集浙江省人民醫(yī)院2001-2003年間125例普通型胃腺癌及癌周正常胃粘膜新鮮標本。首先利用冰凍切片-嗜鉻粒蛋白A(ChromograninA，CgA)單克隆抗體免疫組化篩選含NE細胞較多的胃腺癌組織及相應正常對照組織，然后經激光顯微切割獲取200個左右單個NE細胞、100個左右腺癌癌巢及正常腺體，切割后樣本采用DNAM

7、icro-kit抽提試劑盒及Repli-g擴增試劑盒進行抽提和全基因組放大，其次在全基因組范圍內選取39個微衛(wèi)星位點進行PCR-SSLP分析及通過PCR-測序檢測p53突變發(fā)生情況，最后比較胃腺癌內散在的NE細胞與腺癌細胞微衛(wèi)星改變和p53突變的一致性情況，推測NE細胞的克隆起源。 結果1.免疫組化-激光顯微切割結果：在125例胃腺癌中，中-大量NE細胞占28.8％(36/125)；在對應病例的正常對照胃粘膜中占29.8％(39

8、/121)。其中，胃腺癌及正常胃粘膜中均有中-大量NE細胞的有14例，占11.2％。6例NE細胞含量最多而進行激光顯微切割，在150倍物鏡下捕獲腺癌及正常腺體中單個NE細胞各200個左右，20倍物鏡下捕獲無NE細胞的腺癌癌巢組織及正常腺體100個左右。 2.微衛(wèi)星分析結果：從微衛(wèi)星改變上看，各樣本MSI發(fā)生率高于LOH。從不同細胞微衛(wèi)星改變發(fā)生率上比較，腺癌細胞高于NE細胞。從各位點所在染色體上看，LOH多發(fā)生于4q、5q、11

9、p、17p，位點附近為胃腸道常見腫瘤相關基因，而MSI多發(fā)生于7p、8p、12q、13q、18q。從兩種細胞LOH及MSI一致性上看，例6LOH在NE細胞及腺癌細胞中一致性最高，不一致性最低。例5MSI在NE細胞及腺癌細胞中一致性最高，不一致性最低。例2未發(fā)生一致性LOH而不一致改變的位點較多。各樣本LOH及MSI改變一致性程度從高到低為：例6＞例5＞例4＞例3＞例1＞例2。 3.p53基因外顯子5-8突變結果：6例樣本中，胃腺

10、癌細胞外顯子7、外顯子8及內含子7各有1例發(fā)生突變，突變頻率為50％，而6例樣本中NE細胞各1例發(fā)生外顯子7及內含子7突變，突變頻率為33.3％。序列分析結果顯示，外顯子7為第244位密碼子突變，內含子7為23222位點突變，而外顯子8為第273位密碼子突變。外顯子7及內含子7在兩例樣本(例4、例5)的腺癌細胞及NE細胞中均發(fā)生一致位點及類型的突變，這些患者臨床病理組織學類型均為低分化癌，TNM分期為ⅢA期。外顯子8僅在一例樣本(例1)