氧化還原相關(guān)基因hRRM2及COX2在大腸癌發(fā)生發(fā)展的作用.pdf

1、目的：
　　研究多基因組合——人核糖核苷酸還原酶M2亞基（hRRM2）、Polo樣激酶1（PLK1）、誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶（COX-2）和趨化因子CXCL16在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及在結(jié)腸直腸癌放射增敏作用中的作用機(jī)制機(jī)理。同時(shí)研究特異性COX-2抑制劑——塞來昔布對(duì)大腸癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）細(xì)胞株來源及臨床標(biāo)本取材：課題共選取SW1116、SW620、SW480、HT

2、-29、HCT116、LoVo、Caco-2、Colo205等8株人結(jié)腸癌細(xì)胞系。結(jié)直腸癌組織標(biāo)本取自上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學(xué)中心（2007年~2009年），組織芯片共112點(diǎn)，取自56例結(jié)直腸患者的腫瘤組織和癌旁組織。
　?。?）應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)大腸癌組織芯片（Tissue microarray）進(jìn)行染色評(píng)估，觀察hRRM2、PLK1、COX-2在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)情況；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)（PCR）和免疫印跡（Weste

3、rnblot）技術(shù)分別檢測(cè)多基因hRRM2、PLK1、COX-2、CXCL16及在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況。
　　（3）培養(yǎng)HCT116，SW480和SW1116等7株大腸癌細(xì)胞株用siRNA分別下調(diào)RRM2、PLK1的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Count Kit-8)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后大腸癌細(xì)胞的增殖水平，流式細(xì)胞儀V-FITC（異硫氰酸熒光素）/碘化丙啶（PI）雙標(biāo)記法分析干擾組（siRNA）、陰性對(duì)照組、空白對(duì)

4、照組對(duì)大腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡的影響。
　?。?）應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)研究HCT116分別轉(zhuǎn)染siRRM2和siPLK1后結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的遷移能力變化，應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估分別轉(zhuǎn)染siRRM2和siPLK1后結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的侵襲能力變化。
　?。?）將shRRM2和shPLK分別1處理后的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞置于紫外線光源的照射下，觀察相應(yīng)基因抑制特別是核糖核苷酸還原酶M2亞基表達(dá)抑制后細(xì)胞對(duì)紫外線輻射的致敏作用。

5、>　?。?）應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分選GFP標(biāo)記的腸癌細(xì)胞株，并用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀觀察塞來昔布對(duì)于腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響；應(yīng)用免疫印跡法觀察相關(guān)粘附分子的表達(dá)情況。應(yīng)用血管形成實(shí)驗(yàn)觀察CXCL16對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞的成血管作用。應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察CXCL16和CXCR6在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)定位
　　結(jié)果：
　?。?）結(jié)腸直腸癌組織中RRM2的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0．05)，且與浸潤(rùn)深度(P<

6、0.05)、低分化程度(P=0.0051)、TNM分期(P=0.0015)均具相關(guān)性；PLK1在其中的41例中過表達(dá)，蛋白表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度和大腸癌分化程度具有相關(guān)性。而COX-2基因與腫瘤TNM的分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　?。?）抑制hRRM2、PLK1表達(dá)后，其增殖能力較對(duì)照組明顯下降（P<0.05)
　?。?）在遷徙實(shí)驗(yàn)中和侵襲實(shí)驗(yàn)中，抑制hRRM2、PLK1表達(dá)后，大腸癌細(xì)胞HCT116的遷徙和侵襲能力均受到抑制。

7、
　　（4）hRRM2 shRNA處理細(xì)胞后，細(xì)胞免疫組化方法染色可見處理前細(xì)胞高表達(dá)RRM2蛋白，shRNA處理后細(xì)胞RRM2蛋白的表達(dá)水平明顯下降。RRM2–/–腫瘤細(xì)胞和RRM2敲除后腫瘤細(xì)胞對(duì)紫外輻射的敏感性顯著增加。用shRRM2處理大腸癌細(xì)胞后，紫外輻射下克隆形成能力顯著抑制。shRRM2組aP<0.05 vs HCT116組（6J），bP<0.05 vs HCT116組(8J)，cP<0.05 vs HCT116組(

8、10J)，dP<0.05 vs HCT116組(12J)。8J、48h后HCT116細(xì)胞仍然保持較好的貼壁和粘附狀態(tài)，而經(jīng)過RRM2干擾處理的HCT116細(xì)胞則呈現(xiàn)出凋亡形態(tài)免疫熒光染色觀察UV照射前后，RRM2的表達(dá)位置。UV照射前，RRM2主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)當(dāng)中，經(jīng)UV照射2h后，RRM2蛋白逐漸在細(xì)胞核中表達(dá)。與未經(jīng)UV處理的細(xì)胞相比,五個(gè)鏡野下細(xì)胞核呈現(xiàn)RRM2表達(dá)的細(xì)胞數(shù)均值從4增加至28,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?

9、）塞來昔布對(duì)兩種細(xì)胞間的粘附作用有抑制作用并且與兩種細(xì)胞間的粘附抑制率呈劑量依賴關(guān)系。不同時(shí)間點(diǎn)（4h后，6h后，8h后）、不同濃度梯度藥物對(duì)細(xì)胞間粘附率的影響顯示，塞來昔布對(duì)兩種細(xì)胞間的粘附抑制率與藥物濃度呈依賴關(guān)系（P<0.05)，且10μM，15μM的粘附抑制率顯著高于上述組別，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異（P<0.05)。
　　（6）分別用4μM，6μM，10μM塞來昔布處理Caco-2細(xì)胞8h后，觀察細(xì)胞中VCAM-1蛋白的表

10、達(dá)情況，Western blot檢測(cè)顯示隨著藥物濃度增加，VCAM-1蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)塞來昔布濃度達(dá)到10μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞幾乎觀察不到VCAM-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　hRRM2、PLK1、COX-2在大腸癌組織中呈高表達(dá)，且均與大腸癌的腫瘤浸潤(rùn)深度和放射增敏作用相關(guān)。抑制hRRM2、PLK1都可降低人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷徙、侵襲等腫瘤生物學(xué)行為；下調(diào)核糖核苷酸還原酶M2表達(dá)后結(jié)腸直腸癌細(xì)胞