大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖過(guò)程中Wnt-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）的治療一直是困擾全人類的一個(gè)難題，尤其是伴隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展和人們生活節(jié)奏的日益加快，各種創(chuàng)傷導(dǎo)致的脊髓損傷的發(fā)生率逐年攀升。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年有脊髓損傷病人約5萬(wàn)人，且以每年10%的速度不斷上升。由于脊髓損傷較高的致殘率，且大多數(shù)患者需要長(zhǎng)期住院治療和康復(fù)，給家庭社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。人們嘗試過(guò)無(wú)數(shù)治療脊髓損傷的方法，但都不大理想。近年來(lái)，隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深

2、入，神經(jīng)組織不能再生的傳統(tǒng)觀念受到了挑戰(zhàn)。尤其是神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，為治療包括脊髓損傷在內(nèi)的難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Center neural system，CNS）疾病開(kāi)辟了新的道路。 神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，并具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖潛能，因此具有非常重要的理論研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)移植大量的細(xì)胞特別是神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)促進(jìn)損傷脊髓的功能恢

3、復(fù)已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果，但誘導(dǎo)動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)修復(fù)脊髓損傷方面的研究關(guān)注較少；與移植細(xì)胞相比，激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞因是利用自身資源，它不僅克服了從組織獲取神經(jīng)干細(xì)胞的危險(xiǎn)性和局限性，也避免了組織細(xì)胞移植中存在的倫理、免疫排斥、來(lái)源有限等問(wèn)題，因此在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。 雖然神經(jīng)干細(xì)胞的研究取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞仍了解很少，尤其是對(duì)其體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此，

4、在本研究中，利用BrdU/Nestin標(biāo)記內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的方法，我們觀察了大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖過(guò)程及Wnt-1表達(dá)的規(guī)律，探討了大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞自我增殖變化規(guī)律及其可能機(jī)制。此外，鑒于Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化中起了重要作用，我們探索了是否應(yīng)用氯化鋰能提高脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。 第一部分大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖過(guò)程中Wnt-1的

5、表達(dá)。 目的： 探討大鼠脊髓損傷后信號(hào)蛋白Wnt-1的表達(dá)及其與脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（ENSCs）早期增殖的關(guān)系。 材料及方法： （一）雌性SD大鼠50只，隨機(jī)均分為正常對(duì)照組（A組）、損傷組（B組）。 （二）A組僅暴露椎板，B組采用經(jīng)典的Allen法建立脊髓損傷模型。 （三）于損傷后1天、3天、1周、2周、4周進(jìn)行取材，對(duì)距離損傷中心5mm的脊髓行免疫組化染色，檢測(cè)ENSCs的增殖及Wn

6、t-1蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，統(tǒng)計(jì)分析二者之間的相關(guān)性。 結(jié)果： A組：可見(jiàn)脊髓外周及室管膜區(qū)域極少數(shù)細(xì)胞呈BrdU/Nestin陽(yáng)性，排列稀疏.灰白質(zhì)中幾乎無(wú)BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。與A組相比較，B組BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞在損傷后1d明顯減少，3d后開(kāi)始增加，并超出A組水平，主要見(jiàn)于損傷脊髓組織周圍及室管膜區(qū)，灰質(zhì)和白質(zhì)中出現(xiàn)散在點(diǎn)片狀和絲狀表達(dá)，7d時(shí)BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰。BrdU/

7、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞主要見(jiàn)于室管膜以及環(huán)繞脊髓的軟膜，并向脊髓中央延伸。14d時(shí)BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始下降，28d后明顯下降。 A組中僅見(jiàn)極少量Nestin的表達(dá)。B組在損傷后1d可見(jiàn)少量Nestin表達(dá)，3d時(shí)開(kāi)始增加，7d時(shí)可見(jiàn)較多Nestin陽(yáng)性面積的表達(dá)，主要分布于室管膜周圍區(qū)域及灰質(zhì)中，14d時(shí)開(kāi)始逐漸減少，28d后Nestin陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。Nestin表達(dá)陽(yáng)性的樹(shù)狀突起延伸至灰質(zhì)，在灰質(zhì)中的表達(dá)主要

8、分布于神經(jīng)元附近和血管周圍，個(gè)別細(xì)胞形態(tài)類似星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)在灰質(zhì)偶見(jiàn)少量類似神經(jīng)元樣Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。A組脊髓組織內(nèi)Wnt-1無(wú)明顯表達(dá)。與A組相比，B組各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)Wnt-1的表達(dá)。1d時(shí)就可見(jiàn)脊髓中央管周圍及外膜Wnt-1表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域的出現(xiàn)，脊髓灰白質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)，較為分散，3d后陽(yáng)性區(qū)域的面積達(dá)高峰，7d時(shí)維持在較高水平，之后逐漸減少，28d后僅見(jiàn)極少量Wnt-1陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論： 正常大鼠脊髓中存在著有增

9、殖能力的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，它們保持增生活性狀態(tài)，在損傷后明顯被激活，從而快速增殖，這一過(guò)程發(fā)生的機(jī)制可能與Wnt信號(hào)通路有關(guān)。 第二部分：氯化鋰對(duì)大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響。 目的：探討氯化鋰對(duì)大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響。 方法：75只成年雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、單純損傷組（B組）、損傷后氯化鋰治療組（C組）。A組僅行椎板暴露，B組和C組采用經(jīng)典的Allens法在T10段制作

10、急性脊髓損傷模型，C組于損傷后1小時(shí)給予氯化鋰治療，每日3mmol/Kg腹腔注射，直至取材；B組以相同的方法給予等量生理鹽水。各組分別于損傷后1d、3d、1周、2周、4周進(jìn)行Brdu腹腔注射標(biāo)記，共3次，最后一次標(biāo)記后4小時(shí)取材，對(duì)距離損傷中心5mm處的脊髓進(jìn)行Brdu、β-Catenin的免疫組化檢測(cè)，圖像分析軟件進(jìn)行Brdu陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及β-Catenin陽(yáng)性表達(dá)面積的計(jì)算。 結(jié)果：A組脊髓中央管周圍及外膜可見(jiàn)少量Brdu陽(yáng)

11、性細(xì)胞，幾乎無(wú)β-Catenin陽(yáng)性表達(dá)。B組脊髓損傷后24小時(shí)即可見(jiàn)多量Brdu陽(yáng)性細(xì)胞及微量β-Catenin的表達(dá)，1周時(shí)兩者達(dá)到高峰，主要見(jiàn)于損傷脊髓周圍的灰質(zhì)和室管膜區(qū)，2周后明顯開(kāi)始減少，4周時(shí)僅可見(jiàn)少量Brdu陽(yáng)性細(xì)胞及β-Catenin的陽(yáng)性表達(dá)。C組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞及β-Catenin的表達(dá)在脊髓損傷后24小時(shí)與B組無(wú)顯著性差異，1周時(shí)在中央管周圍、外膜、灰質(zhì)中Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及β-Catenin的表達(dá)量明顯較B組多

12、，至2周時(shí)仍處于較高水平，4周時(shí)仍有多量Brdu陽(yáng)性細(xì)胞及β-Catenin的表達(dá)。 結(jié)論：氯化鋰在大鼠脊髓損傷后能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與Wnt信號(hào)通路有關(guān)。 小結(jié)： 1.正常大鼠脊髓中存在內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞，他們處于“靜止”或“休眠”狀態(tài)，在損傷等特定因素的作用下其分裂、分化的潛能被激活，從而出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。 2.脊髓損傷后，伴隨著內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的逐漸增強(qiáng)，Wnt-1的表達(dá)也逐步增