不同肢體訓練促進腦梗死大鼠腦內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、分化及機制研究.pdf

1、目的：
　　 本實驗通過患側、雙側功能訓練治療后進行行為學測試來了解不同功能訓練的效果；通過患側、雙側功能訓練研究梗死灶同側和對側不同區(qū)域內(nèi)源性NSCs的增殖和分化的情況，對內(nèi)源性NSC的激活時機、激活部位以及定向控制進行初步的探討；研究抑制梗死灶周圍炎性反應及減輕膠質(zhì)細胞形成的瘢痕對雙側功能訓練的結果產(chǎn)生的影響。
　　 方法：
　　 采用Wistar大鼠(成年雄性，270-300g)進行大腦中動脈閉塞(MCAO

2、)模型。部分大鼠在術中頸內(nèi)靜脈注射辣椒素或生理鹽水。MCAO術后24小時，參考Longa等和Bederson的5分制評分標準進行評分，不符合要求或手術后未能生存至預定時間的大鼠被淘汰。隨機選取符合上述標準的64只大鼠(其中注射辣椒素和生理鹽水的大鼠共16只)假手術組16只，未注射辣椒素和生理鹽水的大鼠隨機分成2組(3天組和14天組)，每組又分為4個亞組(患側功能訓練組、雙側功能訓練組、無治療組和假手術組)，假手術組2只，其他亞組各8只。

3、注射辣椒素和生理鹽水的16只大鼠隨機分成2組，3天組和14天組，每組分成假手術組、雙側功能訓練組和雙側功能訓練組+辣椒素組。各組大鼠在網(wǎng)狀制動籠中飼養(yǎng)，其頭端有一容器可放置食物和水源，大鼠的四肢及軀體能被籠中裝置牢固制動?；紓裙δ苡柧毥M和雙側功能訓練組在MCAO術后24小時開始行肢體的功能訓練。訓練內(nèi)容為：每天置于自制滾筒式網(wǎng)狀訓練器內(nèi)進行轉動訓練，平衡木上行走訓練，轉棒上轉動訓練及網(wǎng)屏抓握訓練共40min，1次/d，手術24h后開始治

4、療，至動物處死。在患側功能訓練組中，用膠布將健側上肢纏起來，限制健側肢體的使用，強迫大鼠使用患側上肢。在雙側功能訓練組中，不限制健側肢體的使用，訓練內(nèi)容同患側功能訓練組。無治療組無功能訓練。各組別在MCAO術后3天和術后14天行肢體運動神經(jīng)功能評估后，分別隨機選取4只大鼠，用多聚甲醛心腔灌注處死，快速斷頭取腦，連續(xù)冠狀石蠟切片，HE染色計算腦梗死灶體積，免疫組織化學方法分析Nestin、GFAP和MAP2的染色形態(tài)、分布和強度；免疫熒光

5、雙標分析Nestin/膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidicprotein，GFAP)和Nestin/微管相關蛋白2(microtubule associatedprotein2，MAP2)的染色形態(tài)、分布。另4只生理鹽水心腔灌注，快速斷頭取腦，組織勻漿，Western bloaing定量檢測腦梗死灶周圍皮質(zhì)和對側半球相應腦組織的Nestin、GFAP、MAP2、的蛋白表達量。各檢測指標均同時與sham組大鼠比

6、較。注射辣椒素和生理鹽水的16只大鼠隨機分成2組，3天組和14天組，每組分成假手術組、雙側功能訓練組和雙側功能訓練組+辣椒素組，功能訓練項目同上，分別在MCAO術后3天和14天，斷頭取腦，行免疫組化染色，觀察P物質(zhì)在腦內(nèi)的分布。分別在所有圖像均使用NIH Image J1.31處理軟件分析，全部數(shù)據(jù)均采用SPSS for Windows13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，行單因素方差分析(ANOVA)，比較各組間及各時間點間的差異，P<0.05

7、時，有顯著性意義。
　　 結果：
　　 1、第一部分
　　 (1)神經(jīng)功能綜合評分
　　 術后3天，與無治療組相比，患側和雙側功能訓練組神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與單側功能訓練組比較，雙側功能訓練組神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。術后14天，與無治療組相比，患側和雙側功能訓練組神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與單側功能訓練組比較

8、，雙側功能訓練組神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 (2)組織學的結果
　　 ①梗死體積
　　 3天組和14天組中，患側功能訓練組、雙側功能訓練組和無治療組的梗死體積大小占健側大腦半球的比值無顯著差異。
　　 第二部分
　　 1、免疫組織化學
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 梗死灶周圍Nestin染色：術后3天，無治療組、患側功能訓練組和雙側功能訓練組梗

9、死灶皮質(zhì)周圍Nestin染色顯著增強(P<0.05)。Nestin染色細胞數(shù)目增多，尤以患側和雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)。患側功能訓練組和雙側功能訓練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin染色無顯著差異(P>0.05)。梗死灶周圍皮層GFAP和MAP2染色：術后3天，各組GFAP、MAP2染色增強，尤以患側和雙側功能訓練組明顯，可持續(xù)至MCAO術后14天(P<0.05)?；紓群碗p側功能訓練組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　

10、 (2)對側半球相應腦組織
　　 對側半球相應腦組織Nestin染色：術后3天，與無治療組相比，患側和雙側功能訓練組對側半球相應腦組織Nestin染色顯著增強(P<0.05)。Nestin染色細胞數(shù)目增多，尤以患側和雙側功能訓練組更為明顯。與患側功能訓練組相比較，雙側功能訓練組Nestin染色增強(P<0.05)。與術后3天相比，術后14天雙側功能訓練組的Nestin染色持續(xù)增強(P<0.05)。術后3天，各組CFAP染色增強

11、，尤以雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術后14天。術后14天，各組MAP2染色增強，尤以雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術后14天。
　　 2、免疫熒光雙標檢測Nestin/GFAP和Nestin/MAP2
　　 梗死灶周圍皮層Nestin/GFAP和Nestin/MAP2染色：術后3天，各組Nestin/GFAP、Nestin/MAP2染色增強，尤以患側和雙側功能訓練組明

12、顯，可持續(xù)至MCAO術后14天(P<0.05)?；紓群碗p側功能訓練組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　 對側半球相應腦組織：Nestin/GFAP和Nestin/MAP2染色：術后3天，各組Nestin/GFAP染色增強，尤以雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術后14天。術后14天，各組Nestin/MAP2染色增強，尤以雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術后14天。
　　

13、 2、Western Blot檢測不同部位腦組織Nestin、GFAP和MAP2的表達。
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 術后3天，與無治療組相比，患側功能訓練組和雙側功能訓練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量顯著增強(P<0.05)?；紓裙δ苡柧毥M和雙側功能訓練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量無顯著差異(P<0.05)；術后14天，與無治療組相比較，患側和雙側功能訓

14、練組Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量增強(P<0.05)；與患側功能訓練組相比，雙側功能訓練組的Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量無顯著差異(P<0.05)。與術后3天相比，術后14天患側和雙側功能訓練組的梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量無顯著差異(P<0.05)。
　　 (2)對側半球相應腦組織
　　 術后3天，與無治療組相比，患側和雙側功能訓練組對側半球相應腦組織Nes

15、tin、GFAP和MAP2蛋白的表達量顯著增強，尤以雙側功能訓練組更為明顯(P<0.05)。與患側功能訓練組相比較，雙側功能訓練組Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量增強(P<0.05)。與術后3天相比，術后14天雙側功能訓練組的對側半球相應腦組織Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達量持續(xù)存在。
　　 第三部分
　　 1、神經(jīng)功能綜合評分
　　 術后3天，S組、BT組和BT+C組神經(jīng)功能缺損評分無顯

16、著差異(P<0.05)。術后14天，與BT組相比，BT+C組的神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 2、腦梗死體積
　　 假手術組腦組織呈均勻紅色，未見白色梗死區(qū)；BT組和BT+C組腦組織均可見整個大腦中動脈供血區(qū)呈白色梗死灶，右側腦組織未見白色梗死區(qū)，呈均勻紅色。除假手術組外，在術后3天，其他兩組體積比較無顯著差異(P<0.05)。在術后14天，與BT組相比，BT+C組的梗死體積比明顯減少(P

17、<0.05)。
　　 3、SP免疫組化陽性強度結果
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 梗死灶周圍SP染色：術后3天，假手術組有少量SP染色陽性細胞；BT組和BT+C組梗死灶皮質(zhì)周圍SP染色細胞增多，與BT組相比，BT+C組SP染色細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。術后14天，SP染色細胞持續(xù)存在。與BT組相比，BT+C組SP染色細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。與3天時相比，這種趨勢明顯增高(P<0.05)。如圖9

18、所示。
　　 (2)對側半球相應腦組織
　　 對側半球相應腦組織SP染色：術后3天，BT和BT+C組對側半球相應腦組織SP染色增強(P<0.05)。SP染色細胞數(shù)目增多，BT組和BT+C組SP染色細胞數(shù)目無顯著差異(P<0.05)。與術后3天相比，術后14天BT組和BT+C組的SP染色明顯減少(P<0.05)。BT組和BT+C組SP染色細胞數(shù)目無顯著差異(P<0.05)。如圖10所示。
　　 結論：
　　

19、 1、腦梗塞恢復早期，與患側肢體的運動訓練相比，雙側肢體的運動訓練使運動功能的恢復顯著；患側和雙側運動訓練使梗死灶的體積無明顯變化。
　　 2、患側和雙側功能訓練加強梗死灶周圍皮質(zhì)的內(nèi)源性干細胞的增殖和分化，兩者之間相比無顯著性差異；與患側功能訓練組相比較，雙側運動訓練可以加強對側半球相應腦組織的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖及分化。
　　 3、本實驗的結果為臨床腦梗塞病人的康復提供了方便而實用的治療方法：即患肢和健肢同時的運動