視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)發(fā)生非折疊蛋白反應(yīng)的超微證據(jù)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜視神經(jīng)疾病是主要的致盲性疾病，主要特點為視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞（retinalganglioncell,RGC）及其纖維的漸進性死亡。目前，視網(wǎng)膜視神經(jīng)疾病尚缺乏有效的治療手段。RGC及其纖維漸進性死亡機制是神經(jīng)損傷與再生研究的難點和重點，一直為國內(nèi)外研究者廣泛重視和關(guān)注。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreticulum,ER）是細(xì)胞內(nèi)分泌型及膜性蛋白合成并形成正確三維結(jié)構(gòu)的場所。ER內(nèi)的蛋白折疊微環(huán)境遭到破壞可導(dǎo)致錯誤折疊蛋白

2、的產(chǎn)生，當(dāng)其超過了一定限度，會觸發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生非折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedproteinresponse,UPR）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元及成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞，由于自身的特性，需要合成大量的膜蛋白，因而對各種應(yīng)激刺激非常敏感。已有研究發(fā)現(xiàn)，UPR現(xiàn)象是中樞退行性變性疾病神經(jīng)元丟失的最早原因，如帕金森斯病、早老性癡呆等。最近Ryoo等發(fā)現(xiàn)，干擾果蠅視網(wǎng)膜RGC的蛋白折疊進而引發(fā)UPR，可導(dǎo)致視神經(jīng)遲發(fā)變性死亡，提示UPR也可能是視網(wǎng)膜RG

3、C及其纖維漸進性死亡的首發(fā)病理機制。但上述研究均建立在明確細(xì)胞內(nèi)有變性蛋白的基礎(chǔ)上，對外傷等原因?qū)е碌纳窠?jīng)元丟失尤其是視神經(jīng)損傷是否存在該現(xiàn)象尚缺乏研究。本實驗室首先發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)鉗夾損傷可導(dǎo)致RGC發(fā)生UPR，并且與變性神經(jīng)元染料—Fluoro-JadeC存在共存現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上，本研究采用免疫電鏡結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)進一步研究視神經(jīng)鉗夾損傷后，RGC以及視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UPR，旨在探索視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及其纖維漸進性死亡機制。
　　

4、目的：
　　1．研究大鼠視神經(jīng)夾傷后RGC的非折疊蛋白相關(guān)因子（IRE-1）的表達(dá)，觀察RGC層的變性神經(jīng)元并分析其與IRE-1的關(guān)系。
　　2．采用免疫電鏡雙重標(biāo)記技術(shù)，研究大鼠視神經(jīng)夾傷后RGC以及少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UPR，探討UPR與細(xì)胞變性的關(guān)系，旨在探索視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及其纖維漸進性死亡機制線索。
　　方法：
　　實驗一：建立大鼠視神經(jīng)夾傷模型并行視覺電生理檢查
　　1．建立大鼠視神經(jīng)夾傷模型顯微鏡下暴

5、露成年雄性SD大鼠視神經(jīng)，反向鑷于球后2mm夾傷視神經(jīng)，夾持時間為20s。
　　2．視覺電生理檢查分別檢測正常大鼠及視神經(jīng)夾傷后4h，8h，12h，1d，3d，7d損傷眼F-VEP、ERG變化。
　　實驗二：大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜、視神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化
　　1．將對照組(4只)、損傷組（夾傷后不同時間組即4h，8h，12h，1d，3d，7d，共6組，每組4只）大鼠灌注，按上述時間點制備視網(wǎng)膜、視神經(jīng)冰凍切片。
　　2

6、．常規(guī)HE染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、視神經(jīng)的時空變化。
　　3．神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)每個標(biāo)本在高倍鏡視野下觀察10～15個視野，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)。
　　實驗三：大鼠視神經(jīng)損傷后細(xì)胞變性與非折疊蛋白反應(yīng)
　　免疫熒光組織化學(xué)方法觀察IRE-1及Fluoro-JadeC染色。
　　實驗四：大鼠視神經(jīng)損傷后免疫電鏡研究
　　1.建立大鼠視神經(jīng)夾傷模型，分為夾傷后12h，1d，3d，5d，共4組。
　　2

7、.采用免疫電鏡雙標(biāo)技術(shù)，觀察視網(wǎng)膜中UPR相關(guān)因子IRE-1和AMPA受體，以及IRE-1和少突膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　1．在建立大鼠視神經(jīng)夾傷模型中，未發(fā)現(xiàn)傷口感染及眼底缺血表現(xiàn)。
　　2．視覺電生理檢查：正常大鼠F-VEP峰潛時為62.00±1.65ms、波幅為19.17±2.03μV，視神經(jīng)損傷后各時間點P100波峰潛時均較正常大鼠縮短，至12h時最短，對比正常差異顯著，而后逐漸延長，1d時已長于

8、正常水平；波幅在損傷后明顯下降，各時間點均低于正常水平，4h、1d、3d、7d具有極顯著差異。傷后峰潛時在最大反應(yīng)b波4h、8h和12h，明適應(yīng)ERG的b波各時間點，閃爍反應(yīng)12h，相比正常明顯延長，差異具有顯著性。傷后波幅在最大反應(yīng)b波4h、8h、12h、3d明顯降低，具有極顯著性差異，振蕩電位O2波在1d、3d、7d時升高，具有顯著性差異，明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖在12h時下降，具有顯著性差異。
　　3．形態(tài)學(xué)觀察：大鼠視神經(jīng)夾傷后，

9、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層胞核明顯稀疏，夾傷后4h、8h不明顯，特別是在夾傷后期(1d、3d、7d)，這種病理表現(xiàn)愈加明顯，胞漿成分疏松，節(jié)細(xì)胞層有散在的核染色質(zhì)邊聚、空化的節(jié)細(xì)胞，大而淺染的細(xì)胞核明顯減少，甚至消失，小而深染的細(xì)胞核減少，內(nèi)核層細(xì)胞和外核層細(xì)胞數(shù)目明顯減少，核排列不致密，內(nèi)網(wǎng)狀層明顯變薄，視網(wǎng)膜總厚度變薄，夾傷后7d較明顯。夾傷后7d，節(jié)細(xì)胞數(shù)減少幅度增大。夾傷后4h，8h視神經(jīng)纖維出現(xiàn)連續(xù)性中斷；夾傷后12h，1d，視神經(jīng)干

10、出現(xiàn)明顯夾傷的斷裂帶，伴有出血；夾傷后3d，出血、斷裂帶呈現(xiàn)擴大化的表現(xiàn)，出現(xiàn)格子細(xì)胞浸潤；夾傷后7d，出血消失，大量細(xì)胞壞死。
　　4．免疫組織化學(xué)觀察：Fluoro-JadeC染色在視神經(jīng)夾傷后1d、3d、5d的各個時間點，RGC層胞核排列疏松，排列紊亂，視網(wǎng)膜各層界限較清晰，均可見IRE-1與變性神經(jīng)元在RGC層表達(dá)（紅色標(biāo)記），尤其夾傷后1d組出現(xiàn)IRE-1在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞組織表達(dá)增強，并且在夾傷后3d組IRE-1強表達(dá)細(xì)胞

11、與染色中樞神經(jīng)變性細(xì)胞的染料FJC染色存在共存（黃色標(biāo)記），夾傷后5d表現(xiàn)更為突出，廣泛分布于RGC層、外顆粒層。同時，在夾傷后1d、3d、5d各組FJC染色損傷變性細(xì)胞在RGC層表達(dá)（綠色標(biāo)記），夾傷后1d組FJC淺染，夾傷后3d組FJC深染，同時內(nèi)核層個別雙極/無長突細(xì)胞也出現(xiàn)Fluoro-JadeC陽性反應(yīng)。在夾傷后3d、5d組雙標(biāo)百分比分別增至39.47±12.13％，49.36±9.35％，P<0.01，具有明顯差異.

12、　　5．透射電鏡觀察：正常及夾傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，前者膜結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，層次清楚，邊緣清晰；后者線粒體腫脹，嵴斷裂，空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在包涵體樣物質(zhì)，出現(xiàn)蛋白沉積，髓鞘結(jié)構(gòu)疏松，空泡化，增生加重，典型UPR形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)。正常髓鞘致密光滑，排列規(guī)整。視神經(jīng)夾傷后，出現(xiàn)髓鞘的改變：損傷后髓鞘板層紊亂，排列疏松，髓鞘扭曲，空泡性變。同時可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫大。電鏡下觀察到金顆粒見于RGC，呈單個散在或幾個顆粒聚集分布，清晰

13、地勾勒出細(xì)胞輪廓，胞漿內(nèi)也有少量金顆粒存在，多分布在粗面內(nèi)置網(wǎng)上。除此之外，金顆粒出現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞上。高電子密度的DAB反應(yīng)過氧化物酶免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈茸毛狀均勻地分布于少突膠質(zhì)細(xì)胞，可見圓形、清亮的突觸小泡以及線粒體等細(xì)胞器。
　　6．IRE-1在RGC內(nèi)的分布：在視神經(jīng)鉗夾后，膠體金標(biāo)記IRE-1在RGC內(nèi)的分布均明顯增多，對照組18.4±5.1個、12h組30.4±7.2個、1d組為35.1±6.4個、3d組48.5±9.7個

14、、5d組46.5±9.3，與對照比較，12h組有顯著增多(p<0.05)，1d、3d、5d組均有顯著差異（p<0.01）。在每個膠體金與最近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直線距離上，對照組-1.1±2.2nm、12h組8.8±2.7nm、1d組18.8±2.0nm、3d組19.4±5.7nm、5d組18.6±3.0nm，與對照組比較，12h、1d、3d、5d組均有顯著意義（p<0.01）。IRE-1在少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分布：膠體金標(biāo)記為IRE-1，視神經(jīng)鉗夾后，

15、CNPase標(biāo)記（少突膠質(zhì)細(xì)胞身份標(biāo)志）細(xì)胞內(nèi)膠體金數(shù)目明顯增多，對照組12.3±3.5個、12h組17.4±3.2個、1d組為35.1±6.4個、3d組39.0±13.3個、5d組38.1±10.6個，與對照比較，12h組有增多趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，1d、3d、5d組均有非常顯著意義（p<0.01）。在每個膠體金與最近ER直線距離上，對照組0.3±1.6nm、12h組8.5±2.4nm、1d組14.8±4.1nm、3d組

16、15.3±5.1nm、5d組17.3±5.1nm，與對照組比較，12h、1d、3d、5d組均有非常顯著意義（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)量減少是引起視覺電生理改變的原因。
　　2．視神經(jīng)損傷可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞及RGC產(chǎn)生UPR，UPR發(fā)生早于RGC的丟失，且發(fā)生UPR的RGC是處于變性過程中。
　　3．視神經(jīng)鉗夾導(dǎo)致視神經(jīng)干上的少突膠質(zhì)細(xì)胞以及RGC內(nèi)IRE-1分布部位異常以及膠體