柴胡皂苷a對(duì)IL-1β刺激神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、目的與意義 癲癇是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，其突出的臨床特點(diǎn)是具有反復(fù)發(fā)作性和每次發(fā)作的不可預(yù)知性，極大地影響了癲癇病患者的生活、工作和社會(huì)交往能力，降低了患者的生活質(zhì)量。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球共有癲癇患者約5000萬(wàn)人，其中80%的人在發(fā)展中國(guó)家。目前，我國(guó)癲癇患者人數(shù)已升至900萬(wàn)之多，其中600萬(wàn)病人每年仍有發(fā)作，并且每年有將近40萬(wàn)的新發(fā)病人。 目前控制癲癇

2、仍以化學(xué)藥物為主，常用一線(xiàn)抗癲癇藥如苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平等可使70%～80%的癲癇患者發(fā)作得以控制，但由于這些藥物藥代動(dòng)力學(xué)的局限性，致畸的可能性，對(duì)骨密度的影響，以及對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生的不良作用而導(dǎo)致癲癇患者生活質(zhì)量下降等因素，限制了其應(yīng)用。對(duì)于一些難治性癲癇雖然可選擇外科手術(shù)治療，但由于受到適應(yīng)癥的限制，且存在風(fēng)險(xiǎn)大，費(fèi)用昂貴及復(fù)發(fā)的可能，所以難治性癲癇目前仍以藥物治療為主，這就需要研發(fā)新的抗癲癇藥物。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有較好的抗癲癇

3、作用，但作用機(jī)制往往不明確，從單味中藥活性成分入手研究不僅能明確抗癲癇機(jī)制，還有利于促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。 細(xì)胞因子是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)信息交流的重要載體。一方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)各類(lèi)組織細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作為免疫神經(jīng)介質(zhì)直接影響腦細(xì)胞功能，并參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分泌和修復(fù)過(guò)程。另一方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可通過(guò)不同機(jī)制影響各類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。癲癇作為一種免疫相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子更有著密切關(guān)聯(lián)。

4、IL-1β作為一種重要的細(xì)胞因子，其在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用，已被大量的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。IL-1β參與了癲癇的發(fā)作過(guò)程，其作用的發(fā)揮是通過(guò)其相應(yīng)的高親和力受體IL-1RⅠ實(shí)現(xiàn)的。研究顯示IL-1β在癲癇發(fā)作所伴隨的神經(jīng)元損傷中起重要作用，IL-1β通過(guò)與神經(jīng)元細(xì)胞膜的IL-1RⅠ結(jié)合激活其興奮的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中長(zhǎng)期效應(yīng)主要包括NF-κB高表達(dá)、MAPK通路所致的基因轉(zhuǎn)錄，最終引起神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的改變；其短期效應(yīng)主要是通過(guò)激活激酶（如Src

5、、PI3K），引起快速的離子通道的改變主要為NMDA受體、AMPA受體的離子通道，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度興奮。 柴胡皂苷a（SSa）為我國(guó)傳統(tǒng)中藥柴胡的主要藥理成分柴胡總皂苷的一種單體，前期的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷和SSa可以抗實(shí)驗(yàn)性癲癇，柴胡總皂苷抑制慢性點(diǎn)燃大鼠GFAP的表達(dá)，SSa對(duì)IL-6誘導(dǎo)的大鼠腦電的癇性放電具有較好的抑制作用；此外，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證明SSa對(duì)谷氨酸激活的體外培養(yǎng)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞具有較好的抑制作用

6、，還能夠抑制PTZ誘導(dǎo)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α釋放及TNFR1的高表達(dá)。為進(jìn)一步探討SSa的抗癲癇機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了IL-1β對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的影響及SSa的干預(yù)作用。 二、方法與內(nèi)容 1.PC12細(xì)胞株的培養(yǎng)和誘導(dǎo) 將鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞置于含DMEM/F12培養(yǎng)基[含10%（體積分?jǐn)?shù)）熱滅活馬血清和5%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清]的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待PC12細(xì)胞株

7、生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25%的胰酶消化后離心，離心（800r/min，5min）后棄掉上清，用DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，并將細(xì)胞密度調(diào)整到一定濃度顯微鏡下計(jì)數(shù)后種植于培養(yǎng)板（6孔板或96孔板）；參照Dixon DN[21]誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞：細(xì)胞傳代24h后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含終濃度為50ng/ml的NGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)5天，隔天換液一次，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞模型即神經(jīng)元樣細(xì)胞后，即可用于實(shí)驗(yàn)。 2.SSa對(duì)IL-1β刺

8、激神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響 運(yùn)用MTT法檢測(cè)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞存活率。將鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞置于含DMEM/F12培養(yǎng)基[含10%（體積分?jǐn)?shù)）熱滅活馬血清和5%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清]的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待PC12細(xì)胞株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25%的胰酶消化后離心，離心（800r/min，5min）后棄掉上清，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整到1×104個(gè)/ml顯微鏡下計(jì)

9、數(shù)后種植于96孔培養(yǎng)板，每孔加入200ul細(xì)胞懸液，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代24h后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含終濃度為50ng/ml的NGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)5天，隔天換液一次，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞模型即神經(jīng)元樣細(xì)胞后，細(xì)胞隨機(jī)（隨機(jī)方法參照文獻(xiàn)[20]）分為6組：分為A組（空白對(duì)照）、B組（加入IL-1β10ng/ml刺激）、C組（加入IL-1β10ng/ml+ SSa0.25mg/L）、D組（加入IL-1β10ng/mI+SSa0.

10、5mg/L）、E組（加入IL-1β10ng/ml+ SSa1mg/L）和F組（加入IL-1β10ng/ml+SSa2mg/L），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基配制各組藥物，每孔加入200ul，藥物干預(yù)24h后以MTT法測(cè)OD值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 3.SSa對(duì)IL-1β刺激神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞IL-IRⅠ和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 運(yùn)用western blotting方法分別檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)IL-1

11、RⅠ和NF-κB p65蛋白表達(dá)。將鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞置于含DMEM/F12培養(yǎng)基[含10%（體積分?jǐn)?shù)）熱滅活馬血清和5%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清]的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待PC12細(xì)胞株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25%的胰酶消化后離心，離心（800r/min，5min）后棄掉上清，用DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整到2×105個(gè)/ml顯微鏡下計(jì)數(shù)后種植于六孔培養(yǎng)板，每孔加入1ml細(xì)胞懸液，于37℃5

12、%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含終濃度為50ng/ml的NGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)5天，隔天換液一次，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞模型即神經(jīng)元樣細(xì)胞后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：分為A組（空白對(duì)照）、B組（加入IL-1β10ng/ml刺激）、C組（加入IL-1β10ng/ml+SSa0.25mg/L）、D組（加入IL-1β10ng/ml+SSa0.5mg/L）、E組（加入IL-1β10ng/ml+SSa1mg/L）。用DMEM/F12無(wú)

13、血清培養(yǎng)基配制各組藥物，用藥物干預(yù)24h后，將培養(yǎng)的各組細(xì)胞用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量確定上樣量，運(yùn)用western blotting技術(shù)檢測(cè)IL-1RⅠ和NF-κB p65蛋白表達(dá)的變化，最后用HRP-ECL發(fā)光鑒定，用KODAK成像系統(tǒng)曝光獲取圖像，利用該成像儀綁定的軟件分析灰度值，進(jìn)行定量分析，分別計(jì)算IL-1RⅠ、NF-κB p65條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，作為衡量該組樣品蛋白

14、水平的相對(duì)表達(dá)量。 4.統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，各組MTT比色法結(jié)果和western blotting檢測(cè)結(jié)果比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較用LSD法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、結(jié)論 1.SSa能提高IL-1β刺激神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率，在0.25mg/L～1mg/L濃度范圍內(nèi)隨

15、著SSa濃度的增大其提高神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞存活率的作用也逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)性。當(dāng)SSa濃度繼續(xù)升高到2mg/L時(shí)仍可以提高神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞存活率，但當(dāng)SSa的濃度為2mg/L時(shí)，由于細(xì)胞本身處于無(wú)血清環(huán)境，可能由于高濃度下細(xì)胞外滲透壓增高，反而表現(xiàn)出保護(hù)作用的下降，故在研究蛋白變化時(shí)未再研究此劑量組的作用。 2.一方面SSa可能通過(guò)抑制IL-1RⅠ蛋白表達(dá)進(jìn)一步阻止NF-κB p65蛋白表達(dá)，從而阻斷IL-1β-IL-1