柴胡皂苷a對IL-1β激活大鼠海馬星形膠質細胞的干預及機制研究.pdf

1、一、目的與意義： 癲癇是一組反復發(fā)作的神經元異常放電所致的短暫性中樞神經系統(tǒng)功能失常的慢性疾病。我國流行病學調查表明癲癇的患病率為4.6‰。 傳統(tǒng)抗癲癇藥如苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平、乙琥胺等一直是治療癲癇的主要藥物，但藥代動力學的局限性，致畸的可能性，對骨密度的影響，以及對認知功能產生的不良作用而導致癲癇患者生活質量下降等因素，限制了其應用。大約30％癲癇病人對各種療法包括藥物、癲癇手術、迷走神經刺激等耐受，這就需要

2、研發(fā)新的抗癲癇藥物。中藥可通過調節(jié)神經遞質、調控離子通道、抑制神經膠質細胞增生、清除自由基等實現(xiàn)抗癲癇作用，而單味中藥的活性成分研究不但能明確抗癲癇機制，還有利于促進中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。 細胞因子可調節(jié)神經元的功能與代謝，IL-1β能夠通過兩種途徑增強谷氨酸介導的神經元興奮性：增強細胞外谷氨酸濃度，增強NMDA受體功能。IL-1β通過激活NF-KB和MAPK依賴性的基因引起長期效應，包括神經膠質和神經網絡的結構和功能改變。

3、星形膠質細胞可參與神經活動的主動控制和神經突觸傳遞過程。癲癇發(fā)作激活星形膠質細胞，引起反應性膠質增生，表現(xiàn)為細胞增殖、肥大，一些骨架蛋白如星形膠質細胞特異性表達的膠質纖維酸性蛋白及星形膠質共同標記一波形蛋白表達上調。體外研究證實MAPK介導細胞因子對星形膠質細胞的誘導。JNK/SAPK信號通路可被細胞因子、應激刺激、生長因子及某些G蛋白偶聯(lián)的受體激活。 柴胡皂苷a為我國傳統(tǒng)中藥柴胡中主要藥理成分柴胡皂苷的一種單體成分，我們前期的

4、研究發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷和SSa可以抗實驗性癲癇、抑制慢性點燃大鼠GFAP的表達；影響戊四氮點燃大鼠海馬CA1區(qū)的Glu表達水平。本研究觀察了SSa對炎性因子IL-1β激活的體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質細胞的干預及其機制研究。 二、方法與內容： 1.大鼠海馬星形膠質細胞的培養(yǎng)與鑒定 星形膠質細胞的原代培養(yǎng)參考McCarthy法加以改進。取新生SD大鼠海馬，剪碎，消化，離心，差速貼壁40min后，按106個/ml接種。37.

5、0℃，5％Co2孵箱中培養(yǎng)7-9d，待培養(yǎng)的細胞70％-80％融合時，將培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉搖床上搖18h(37.0℃，240r/min)后，進行傳代培養(yǎng)即得純化的星形膠質細胞，純化的細胞進一步運用免疫細胞化學SABC法進行鑒定。 2.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞活性的影響 2.1活細胞數(shù)目與OD值線性檢驗：純化的細胞經臺盼藍染色計數(shù)，用15％完全培養(yǎng)基按8×104個/ml的密度傳代，分別取10μl、25μ

6、l、50μl、75μl、150μl接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔以完全培養(yǎng)基補至200μl，每個劑量設4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，MTT測OD值。 2.2實驗用細胞傳代按7×104個/ml的密度用15％完全培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔種植200μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，細胞隨機分為5組：對照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa劑量組，每組設6孔。用含5％胎牛血清的培養(yǎng)基配制不同藥物，每孔加入200

7、μl，干預72h后，MTT法測OD值。 3.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞分裂周期的影響 運用流式細胞技術檢測各組星形膠質細胞的細胞周期。將傳代細胞以5×105個/ml密度種植于75cm2的培養(yǎng)瓶中。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，DMEM/F12無血清養(yǎng)培養(yǎng)基血清剝奪24h，細胞隨機分為4組：對照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa不同劑量組。用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基配制不

8、同藥物，加藥刺激24h后終止作用，細胞用預冷的70％乙醇固定，PI染色并調整細胞密度為106個/ml，流式細胞技術檢測各組星形膠質細胞細胞周期，每組樣本檢測104個細胞，以細胞指數(shù)表示分布于細胞周期各時相的細胞百分比數(shù)，以增殖指數(shù)反映細胞增殖狀態(tài)。 4.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞GFAP、vimentin、p-JNK、NF-KB表達的影響 運用Western-blot法分別檢測各組星形膠質細胞GFAP、

9、vimentin、p-JNK、NF-KB表達量。傳代細胞以5×105個/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后，DMEM/F12無血清養(yǎng)培養(yǎng)基血清剝奪24h后，將細胞隨機分為4組：對照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa不同劑量組。用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基配制不同藥物，加藥刺激24h后終止作用，全蛋白提取試劑盒提取蛋白，考馬斯亮藍法蛋白定量以確定上樣量，運用Western-blot技術檢測GFA

10、P、vimentin、p-JNK、NF-KB表達的變化，對結果進行光密度分析，計算不同蛋白與β-actin的比值。每組蛋白檢測6次。 5.統(tǒng)計方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量數(shù)據以X±S表示，各組MTT比色法結果和western-blot檢測結果比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD法：活細胞數(shù)目與OD值線性檢驗采用CurveEstimation；流式細胞術檢測結果比較采用卡方檢驗，P<0.05表示差異

11、具有統(tǒng)計學意義。 三、結果： 1.大鼠海馬星形膠質細胞的原代培養(yǎng)和鑒定 原代培養(yǎng)的大鼠海馬星形膠質細胞，鏡下觀察可見星形膠質細胞生長較好，所有細胞均貼壁，可見光暈，胞突明顯，細胞向外伸出長短不一的突起，細胞質中可見一清晰的卵圓形的細胞核，胞質豐富。原代培養(yǎng)的星形膠質細胞運用免疫細胞化學染色法鑒定，細胞GFAP免疫反應陽性率為95％以上。 2.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞活性的影響

12、經CurveEstimation統(tǒng)計分析，活細胞數(shù)目與MTT法所測OD值成線性，RSquare=0.997，P<0.001。 SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞活性的影響：含IL-1β的激活組的OD值高于對照組且有顯著性差異，說明IL-1β對星形膠質細胞具有促增殖的激活作用。SSa各劑量組OD值均低于激活組，差異有統(tǒng)計學意義，說明SSa可抑制IL-1β激活下星形膠質細胞的異常增殖。SSa2mg/L組OD值顯著性低于對照

13、組，SSa0.5mg/L組顯著性高于對照組，而SSa1mg/L組和對照組無統(tǒng)計學差異。 3.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞分裂周期的影響 各組流式細胞結果顯示：各組細胞的增殖指數(shù)有顯著性差異，IL-1β激活組的增殖指數(shù)較control組高，說明IL-1β對星形膠質細胞具有促增殖的激活作用。SSa各劑量組增殖指數(shù)均低于激活組，說明各劑量組對激活的細胞的分裂周期均有一定的阻滯作用。其中SSa1mg/L的增殖指數(shù)

14、較其他組低與對照組最接近，說明此劑量組對激活膠質細胞分裂周期的阻滯作用較其他組強。 4.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞GFAP表達的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的GFAP光密度值較對照組增加1.5倍，且有顯著性差異，說明IL-1β激活的星形膠質細胞特異性蛋白GFAP表達量顯著增加。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，SSa1，0.5mg/L可使星形膠質細

15、胞GFAP表達分別下降34.7％和53.2％。SSa1mg/L給藥組光密度值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。 5.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞vimentin表達的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的光密度值較對照組增加1.2倍，且有顯著性差異，說明IL-1β激活的星形膠質細胞表達vimentin顯著增加。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，SSa1，0.5

16、mg/L可使星形膠質細胞vimcntin表達量分別下降17.6％和23.8％。SSa1mg/L給藥組光密度值與對照組比較，無顯著性差異。 6.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞p-JNK表達的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的p-JNK光密度值較對照組增加1.1倍，且有顯著性差異。SSa1，0.5mg/L兩組的光密度值較激活組顯著降低，分別下降7.7％和8.6％。

17、與對照組比較，SSa1mg/L給藥組光密度值差異無統(tǒng)計學意義。 7.SSa對IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質細胞NF-KB表達的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組NF-KB光密度值較對照組增加1.5倍，且有顯著性差異。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，可使星形膠質細胞GFAP表達下降。 四、結論： 1.SSa能夠抑制IL-1β激活引起的“反應性星形膠質細胞