人參皂甙Rg1對腦缺血再灌注致小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機制探討.pdf

1、腦血管疾?。–erebrovascular disease, CVD）是各種血管源性腦病變引起的腦功能障礙，是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，死亡率約占所有疾病的10％，是目前人類疾病三大死亡原因之一，50％～70％的存活者遺留癱瘓，癡呆及失語等嚴(yán)重殘疾，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。而缺血性腦血管病是腦血管病中最常見的一種，約占腦血管病70～80％。癡呆是CVD 后期的常見并發(fā)癥，有研究報告發(fā)現(xiàn)，78％的腦血管病人伴有不同程度的認(rèn)知能力下降，癡

2、呆也是老年人致殘的常見原因，在65～70 歲老年人發(fā)病率為1.4％,85 歲以上達(dá)到23.6％。癡呆的典型病理變化為大腦皮質(zhì)、海馬等與認(rèn)知記憶有關(guān)部位的神經(jīng)元大量變性死亡，數(shù)目明顯減少。目前腦血管疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因此防治CVD 后期所引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。以往研究發(fā)現(xiàn)大腦短暫性缺血可導(dǎo)致皮質(zhì)海馬部位神經(jīng)元大量變性凋亡，從而引起了患者認(rèn)知功能障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中具有關(guān)鍵

3、性作用，線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量工廠，細(xì)胞缺血缺氧時可引起線粒體氧化呼吸鏈電子傳遞障礙，線粒體內(nèi)部細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動。Caspase 凋亡信號通路是目前認(rèn)為比較經(jīng)典的路徑，線粒體功能障礙時可激活Caspase 家族蛋白，首先活化的Caspase-9，依次活化下游蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆死亡。因此探索抑制Caspase 相關(guān)家族蛋白活化，對于防止細(xì)胞凋亡具有重要意義。 人參皂甙Rg1（Ginsenoside Rg1）是人參重要的

4、活性成分之一，近年來人參皂甙Rg1 的的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用受到人們的關(guān)注，研究表明其對帕金森?。╬arkinson,s disease,PD）發(fā)病過程中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡具有一定的抑制作用，提示其可能在防治PD 病變中具有積極作用，然而人參皂甙Rg1 對于大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷是否也具有保護(hù)作用，值得進(jìn)一步研究。NKs 是一個結(jié)構(gòu)相似的速激肽家族，主要包括P 物質(zhì)(Neurokinin-1,NK1)、神經(jīng)激肽A(NK2)、神經(jīng)

5、激肽B(NK3)，其生物學(xué)效應(yīng)由相應(yīng)的NK1、NK2和NK3 受體（G 蛋白偶聯(lián)受體）來介導(dǎo)。研究表明神經(jīng)激肽-神經(jīng)激肽受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布十分豐富，提示神經(jīng)激肽在神經(jīng)元生理和病理過程中可能具有重要作用。NK-4R 是研究發(fā)現(xiàn)的一種新型神經(jīng)激肽受體，目前對于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布特征還不清楚。 因此本課題的主要目的在于以前幾個方面： (1) 觀察NK-4R 在大腦皮質(zhì)部位神經(jīng)細(xì)胞上是否有分布以及分布特征； (2

6、) 觀察人參皂甙Rg1 是否對缺血再灌注致皮質(zhì)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用； (3) 探討人參皂甙Rg1 神經(jīng)保護(hù)作用機制是否與抑制Caspase 家族蛋白活化有關(guān)。這些問題的研究將為腦血管疾病后期神經(jīng)細(xì)胞損傷凋亡以及癡呆的防治提供一些實驗依據(jù)。 本課題所采用的實驗方法包括：采用動物實驗研究、短暫反復(fù)結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈制備腦缺血再灌注損傷模型、給予人參皂甙Rg1 進(jìn)行藥物干預(yù)、采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，熒光雙標(biāo)及激光共聚焦顯微鏡

7、技術(shù)等方法，主要探討和分析NK-4R 在大腦皮質(zhì)的分布特征；NK-4R 標(biāo)記的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元在人參皂甙Rg1 藥物干預(yù)組，模型損傷組以及空白對照組之間是否存在數(shù)目變化差異；人參皂甙Rg1 的神經(jīng)保護(hù)機制是否與粒體功能障礙時Caspase 家族蛋白活化有關(guān)。主要實驗結(jié)果包括： (1) NK-4R 免疫陽性產(chǎn)物在大腦皮質(zhì)的錐體細(xì)胞層（Ⅲ、Ⅵ層）分布最多,在皮質(zhì)內(nèi)、外顆粒層、多形層（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ層）也有分布，其陽性產(chǎn)物表達(dá)于神經(jīng)元胞體和

8、突起的膜表面，是一種細(xì)胞膜受體。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果觀察到NK-4R 與神經(jīng)元胞核特異性標(biāo)記物NeuN 共存（100％，146/146，雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目/NK-4R 陽性細(xì)胞數(shù)目），且不與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP 共存，證實NK-4R 確實是分布于神經(jīng)細(xì)胞膜上。 (2) 人參皂甙Rg1 對小鼠腦缺血再灌注致皮質(zhì)神經(jīng)元損傷存在一定的神經(jīng)保護(hù)作用。人參皂甙Rg1 能夠增加神經(jīng)細(xì)胞活力，減少皮質(zhì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的死亡數(shù)目。而模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞

9、活力降低，存活的神經(jīng)元的死亡數(shù)目明顯少于給藥組。 (3) 人參皂甙Rg1 神經(jīng)保護(hù)機制可能與Caspase 凋亡通路中一個非常重要的因子，Caspase-9 活性的抑制有關(guān)。模型組動物大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞核Caspase-9 表達(dá)數(shù)目增加，顯著多于空白組和人參皂甙Rg1 中劑量組。 主要結(jié)論： (1) NK-4R 免疫陽性產(chǎn)物在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分布表達(dá)，提示NK-4R 可能參與了哺乳類動物大腦皮質(zhì)神經(jīng)元功能調(diào)節(jié)和病變

10、過程。 (2) 人參皂甙Rg1 能夠抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血導(dǎo)致的損傷凋亡，表明一定劑量的人參皂甙Rg1 可能具有阻止腦血管疾病中神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。 (3) 人參皂甙Rg1 神經(jīng)保護(hù)機制可能與降低Caspase-9 的表達(dá)有關(guān)，此機制還有待于進(jìn)一步探討。 本實驗為NK-4R 的進(jìn)一步研究提供了一些形態(tài)方面的依據(jù)；同時也為人參皂甙Rg1 防止腦血管疾病后期的神經(jīng)病變的防治給出了一些實驗參考；神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一個由多個