血管緊張素Ⅱ調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)在升主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　胸主動(dòng)脈瘤是指胸主動(dòng)脈擴(kuò)張并且直徑超過(guò)正常值的1.5倍。大部分位于升主動(dòng)脈，稱之為升主動(dòng)脈瘤(aneurysmal aortic thoracic aneurysm, ATAA)。主動(dòng)脈瓣二瓣化畸形(Bicuspid Aortic Valve，BAV)是最常見(jiàn)的先天性心臟病，發(fā)病率高達(dá)1-2％。相比主動(dòng)脈瓣三葉瓣(Tricuspid Aortic Valve，TAV)的升主動(dòng)脈瘤患者，BAV患者發(fā)生升主動(dòng)脈瘤的幾率和風(fēng)

2、險(xiǎn)明顯增高。最近，基因和蛋白組學(xué)的研究結(jié)果表明主動(dòng)脈瓣二瓣化畸形畸形和正常的三葉瓣膜伴發(fā)升主動(dòng)脈瘤的病理機(jī)制是不相同的。
　　有研究表明基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)尤其是主動(dòng)脈中層的平滑肌分泌的MMP-2在ATAA中表達(dá)明顯增高，增高的MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)如彈力和膠原纖維，破壞主動(dòng)脈壁的正常結(jié)構(gòu)和升主動(dòng)脈在血流動(dòng)力學(xué)作用下進(jìn)行性擴(kuò)張，從而誘發(fā)ATAA產(chǎn)生。然而MMP-2在BAV和T

3、AV伴發(fā)的ATAA表達(dá)不清楚并且主動(dòng)脈壁中的MMP-2升高的分子和細(xì)胞機(jī)制也不清楚。
　　有研究表明ERK1/2，JNK及磷酸化水平在腹主動(dòng)脈瘤中升高，而涉及腹主動(dòng)脈瘤形成與進(jìn)展。然而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是否涉及胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)病，未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。并且MAPK信號(hào)通路在ATAA的BAV和TAV亞型的表達(dá)是否有差異更是未見(jiàn)報(bào)道。
　　當(dāng)前越來(lái)越多

4、的臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)表明AngⅡ參與了胸主動(dòng)脈瘤的形成和進(jìn)展，除了AngⅡ外，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)其他成分血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)血管緊張素受體(angiotensin type receptor, ATR)等也被涉及胸主動(dòng)脈的發(fā)病機(jī)制。當(dāng)前研究存在一些問(wèn)題，如樣本量過(guò)小，病例數(shù)大多在個(gè)位數(shù)，集中在結(jié)締組織病相

5、關(guān)的ATAA研究上，而對(duì)非結(jié)締組織相關(guān)的ATAA的研究鮮有報(bào)道，而且研究只是限于RAS的某一種成分，尚缺乏較為全面的研究RAS在ATAA的表達(dá)的報(bào)道。
　　Wang等研究者表明在大鼠的頸動(dòng)脈中AngⅡ能夠誘導(dǎo)大鼠的頸動(dòng)脈表達(dá)MMP-2增加。在大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路被報(bào)道參與AngⅡ介導(dǎo)的MMP-2表達(dá)。然而在人胸主動(dòng)脈瘤平滑肌細(xì)胞中，AngⅡ是否也能上調(diào)MMP-2表達(dá)，MA

6、PK通路是否涉及該過(guò)程還未闡明。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)臨床組織標(biāo)本，分析ATAA及其BAV和TAV亞型的病理學(xué)和分子學(xué)特征，探討MMP-2，MAPK, RAS在ATAA及其BAV和TAV亞型的表達(dá)，尋求BAV高發(fā)ATAA可能的原因。在細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)水平探明AngⅡ，MMP-2與MAPK之間的聯(lián)系，并提出其可能的分子機(jī)制，為ATAA的預(yù)防與治療提供理論支持。
　　研究方法與結(jié)果:
　　為實(shí)現(xiàn)上述目的，我們進(jìn)行了如下四部分實(shí)

7、驗(yàn)。
　　1.第一部分基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2在主動(dòng)脈瓣二瓣化畸形膜畸形與三葉瓣膜伴發(fā)升主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)研究。
　　我們選取2013年2月至2014年10月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院血管外科中心住院的升主動(dòng)脈瘤患者，20例TAV患者，20例BAV患者;排除結(jié)締組織主動(dòng)脈疾病(Marfan綜合癥，Loeys-Dietz綜合癥，Ehler-Danlos綜合癥)、家族性主動(dòng)脈瘤、炎癥性主動(dòng)脈疾病、感染性主動(dòng)脈疾病，梅毒性主動(dòng)

8、脈疾病，外傷性主動(dòng)脈疾病。在外科手術(shù)切除升主動(dòng)脈時(shí)獲取標(biāo)本。對(duì)照組來(lái)自20例同期住院的無(wú)升主動(dòng)脈疾患的冠心(coronary heart diseases，CHD)患者，在行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)時(shí)獲取升主動(dòng)脈與大隱靜脈吻合時(shí)打孔取下的升主動(dòng)脈壁，還有5例心臟移植器官供體的升主動(dòng)脈。通過(guò)HE染色和彈力纖維EVG染色，觀察5例BAV患者，5例BAV患者，5例心臟移植供體的主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，彈力纖維，膠原纖維等情況。運(yùn)用蛋白免疫

9、印跡Western blot及熒光定量PCR技術(shù)研究MMP-2在ATAA的表達(dá);從瓣膜和主動(dòng)脈兩個(gè)水平去研究MMP-2表達(dá)在BAV和TAV伴發(fā)升主動(dòng)脈瘤患者之間的差異。
　　我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAV合并的ATAA的升主動(dòng)脈中層可見(jiàn)到嚴(yán)重的彈力纖維斷裂，數(shù)量減少和大量的膠原纖維聚集，大量的平滑肌細(xì)胞減少和內(nèi)、外、中膜都可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組和TAV合并的ATAA的升主動(dòng)脈的內(nèi)膜和中層表現(xiàn)了完整和有序的彈力纖維，少量的膠原纖維;

10、中層見(jiàn)到均勻的分布予主動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞，動(dòng)脈的各層未見(jiàn)有炎癥細(xì)胞。在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平，相比對(duì)照組的正常升主動(dòng)脈，BAV和TAV患者的升主動(dòng)脈壁中MMP-2表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步在BAV患者，MMP-2蛋白表達(dá)也明顯高于TAV患者。MMP-2的在BAV和TAV瓣膜組織之間的表達(dá)也是有差異的，與在主動(dòng)脈組織的結(jié)果是一致的。BAV和TAV患者的血漿中MMP-2含量高于CHD患者，而在BAV和TAV患者之間血漿中MMP-2無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<

11、br>　　2.第二部分絲裂原活化蛋白激酶MAPK在主動(dòng)脈瓣二瓣化畸形畸形與三葉瓣膜合并升主動(dòng)脈瘤的表達(dá)研究。
　　我們選取的病例組和對(duì)照組主動(dòng)脈標(biāo)本同第一部分。利用Western blot技術(shù)對(duì)MAPKs分子在升主動(dòng)脈瘤及在BAV和TAV亞型中的表達(dá)情況進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-JNK和t-JNK蛋白表達(dá)及p/t-JNK水平在BAV和TAV伴發(fā)的升主動(dòng)脈瘤中升高，p54JNK蛋白及其磷酸化水在BAV患者升主動(dòng)脈

12、的表達(dá)要高于TAV患者，然而在瓣膜組織TAV患者JNK卻明顯高于BAV患者。P-ERK1/2，t-ERK1/2及p/t-ERK1/2水平在CHD，BAV, TAV患者的升主動(dòng)脈中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而在瓣膜組織可見(jiàn)到TAV患者的t-ERK1/2蛋白水平明顯高于BAV患者。t-p38MAPK蛋白表達(dá)在BAV和TAV患者升主動(dòng)脈中升高，相比CHD對(duì)照組的正常的升主動(dòng)脈。并且TAV患者升主動(dòng)脈的t-p38MAPK蛋白水平也高于BAV組。但在瓣

13、膜組，兩者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。p38MAPK磷酸化水平在BAV和TAV患者的升主動(dòng)脈中并不高。然而相比BAV組，TAV組p-p38MAPK是明顯升高的。進(jìn)一步，在瓣膜組織，BAV和TAV組p-p38MAPK水平是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。p/t-p38MAPK在CHD，BAV, TAV患者的升主動(dòng)脈和瓣膜組織中表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.第三部分腎素-血管緊張素系統(tǒng)RAS在升主動(dòng)脈瘤的表達(dá)。
　　我們選取40例升主動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本，取自

14、2013年2月至2013年12月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院血管外科中心手術(shù)切除的升主動(dòng)脈瘤壁。經(jīng)術(shù)前心臟超聲或主動(dòng)脈CT確定升主動(dòng)脈最大直徑中位數(shù)5.1cm(4.5-6.6cm)。對(duì)照組的正常升主動(dòng)脈來(lái)自40例同期的冠心病(coronary heart diseases，CHD)患者，在阜外心血管病醫(yī)院血管外科中心行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)時(shí)升主動(dòng)脈與大隱靜脈吻合時(shí)打孔取下的升主動(dòng)脈壁，5例心臟移植器官供者的升主動(dòng)脈。排除結(jié)締組織主動(dòng)脈

15、疾病（Marfan綜合癥，Loeys-Dietz綜合癥，Ehler-Danlos綜合癥）、家族性主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈瓣二瓣化畸形、炎癥性主動(dòng)脈疾病、感染性主動(dòng)脈疾病，梅毒性主動(dòng)脈疾病，外傷性主動(dòng)脈疾病;利用蛋白免疫印跡Western blot，放射免疫法RIA和免疫熒光技術(shù)對(duì)局部RAS主要成分在非馬凡特發(fā)性的升主動(dòng)脈瘤的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。
　　我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比CHD患者，血管緊張素原AGT的表達(dá)、AngⅡ的水平、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶A

16、CE的活性在ATAA患者的升主動(dòng)脈中升高。而且，血漿中AngⅡ含量ATAA患者也高于CHD患者。
　　4.第四部分血管緊張素Ⅱ促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2在升主動(dòng)脈瘤平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的機(jī)制研究。
　　我們通過(guò)體外培養(yǎng)患者的升主動(dòng)脈瘤組織塊及升主動(dòng)脈瘤的平滑肌細(xì)胞和正常胸主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞，去弄清升主動(dòng)脈瘤中MMP-2增高的機(jī)制，探究AngⅡ，MAPK，MMP-2在升主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的聯(lián)系。
　　我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的

17、患者的升主動(dòng)脈瘤組織塊及升主動(dòng)脈瘤的平滑肌細(xì)胞和正常胸主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞中，AngⅡ均呈現(xiàn)了以濃度和時(shí)間依賴方式促M(fèi)MP-2的表達(dá)。AngⅡ能夠誘導(dǎo)升主動(dòng)脈瘤的平滑肌細(xì)胞的JNK, ERK1/2，p38MAPK磷酸化水平。而在正常胸主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞中，只見(jiàn)到AngⅡ誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，而未見(jiàn)到JNK和p38 MAPK發(fā)生磷酸化。AngⅡ通過(guò)血管緊張素Ⅱ受體1誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)上調(diào)及MAPK分子磷酸化。AngⅡ通過(guò)激活JNK，ERK

18、1/2，p38 MAPK通路誘導(dǎo)升主動(dòng)脈瘤平滑肌細(xì)胞表達(dá)MMP-2，而在正常胸主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞中，只有ERK1/2通路參與該過(guò)程。
　　結(jié)論:
　　1.MMP-2表達(dá)增加是升主動(dòng)脈瘤發(fā)病的重要因素。
　　2.主動(dòng)脈瓣膜二瓣化相對(duì)高發(fā)胸主動(dòng)脈瘤可能與瓣膜及升主動(dòng)脈MMP-2表達(dá)增加有關(guān)。
　　3.JNK的激活可能涉及升主動(dòng)脈瘤形成。
　　4.BAV和TAV伴發(fā)的ATAA有不同的MAPK分子的表達(dá)和激活，表明

19、兩者可能涉及不同的MAPK分子機(jī)制。
　　5.BAV伴發(fā)的ATAA的p54JNK水平的增高可能有助于解釋BAV伴發(fā)的ATAA高的MMP-2水平。
　　6.TAV伴發(fā)的ATAA的升主動(dòng)脈壁病理改變要比BAV重。
　　7.RAS參與了ATAA的發(fā)病過(guò)程。
　　8.AngⅡ能夠誘導(dǎo)升主動(dòng)脈瘤平滑肌細(xì)胞MMP-2表達(dá)上調(diào)，這可能是ATAA MMP-2表達(dá)上調(diào)的重要原因，
　　9.ARB藥能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ATA