大鼠AQP4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及病毒滴度測定方法的建立.pdf

1、腦水腫是缺血性腦血管病的基本病理變化之一,與疾病的預后密切相關(guān),目前對腦水腫的治療尚不能令人滿意.近期研究發(fā)現(xiàn)AQP4(aquaporin-4)在腦組織水的運輸中起關(guān)鍵性作用,缺血后腦內(nèi).AQP4蛋白表達上調(diào)可能是缺血后腦水腫的重要誘發(fā)因素,抑制AQP4的表達為治療缺血后腦水腫提供了新思路.RNai(RNA interference)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的高效特異的阻斷基因表達的新手段,具有廣泛的應(yīng)用前景.由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的特殊性,

2、多數(shù)RaNAi載體難以發(fā)揮作用,嚴重影響了RNAi的干擾效果.來源于人類免疫缺陷病毒-1(HTV-1)的慢病毒載體(LV,lentiviral vector)可以通過整合攜帶shRNA(small hairpin RNA)感染包括神經(jīng)元在內(nèi)的非分裂細胞,而且感染效率高、免疫反應(yīng)低,已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)基因功能研究和基因治療中.本實驗構(gòu)建了針對大鼠AQP4基因的慢病毒RNAi載體,完成了病毒顆粒的包裝,為進一步體內(nèi)外研究阻斷AQP4對腦水

3、腫的影響奠定了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ);采用嘌呤霉素(puromycin)抗性篩選測定了病毒滴度,建立了一種新的慢病毒滴度測定方法. 目的: 1.構(gòu)建重組大鼠AQP4 shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒PLKO-1-puro-shAQP4,產(chǎn)生穩(wěn)定表達大鼠AQP4 shRNA的濃縮慢病毒顆粒; 2.探索一種準確、方便、快捷的慢病毒滴度測定方法. 方法: 1.設(shè)計并合成大鼠AQP4基因特異性的DNA寡核苷酸模板,

4、退火后連接到經(jīng)Age I和EcoRI雙酶切的PLKO-1-puro載體質(zhì)粒上,形成重組質(zhì)粒PLKO.1-puro-shAQP4;轉(zhuǎn)化大腸桿菌(escherichia.coli,E.coli)DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性菌落、擴增后提取質(zhì)粒,MluI和BamHI雙酶切及測序鑒定.2.將重組載體質(zhì)粒PLKO.1-puro-shAQP4、包裝質(zhì)?！?.2和包膜質(zhì)粒VSV-G經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6共轉(zhuǎn)染293T細胞,產(chǎn)生穩(wěn)定表達大鼠AQP4

5、shRNA的慢病毒顆粒,超速冷凍離心濃縮病毒顆粒.3.將病毒顆粒進行系列稀釋后感染Eca9706細胞,采用嘌呤霉素最小致死量篩選病毒感染細胞的方法,進行慢病毒滴度測定. 結(jié)果:1.設(shè)計并合成了2對寡核苷酸模板,重組到慢病毒載體質(zhì)粒PLKO.1-puro中后,相應(yīng)地篩選出2種陽性菌落.2.重組慢病毒載體質(zhì)粒PLKO.1-puro-shAQP4經(jīng)過酶切和測序鑒定顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.3.三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T產(chǎn)生出慢病毒顆粒,并進行了