人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒載體的構(gòu)建及其功能的相關(guān)性研究.pdf

1、與張力蛋白同源的10號染色體缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的磷酸酶家族中首個抑癌基因,PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性,其脂質(zhì)磷酸酶活性可以去掉3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)3位上的磷酸基團,使其轉(zhuǎn)化為4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),從而調(diào)控細胞的增殖與凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以

2、抑制黏著斑激酶(FAK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化,調(diào)節(jié)細胞的黏附及遷移。研究發(fā)現(xiàn)多種實體瘤中存在有PTEN基因的突變、等位基因的缺失或低表達,急性白血病(acute leukemia,AL)中也存在有PTEN基因不同程度的缺失、低表達、甲基化。但是PTEN基因及其蛋白的異常如何在AL的發(fā)生發(fā)展、血管新生及髓外浸潤過程中發(fā)揮作用仍有待于進一步探討。
　　 兒童AL是一組起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病。它是由于不成熟

3、的淋巴系或髓系祖細胞在發(fā)育成熟過程中失去調(diào)控,從而呈克隆性擴張,使得細胞被阻滯于一定的分化期而發(fā)生的。AL的發(fā)病機制目前多認為是環(huán)境因素、遺傳因素以及癌基因和抑癌基因等多種致病因素綜合作用的結(jié)果。近年來由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,多種抑癌基因在AL發(fā)病中的作用越來越明確。PTEN在AL發(fā)病機制中的作用越來月受到重視。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)可高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達,是研究內(nèi)源

4、性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的強有力工具。但是在RNAi過程中常有“脫靶效應(yīng)”的發(fā)生,造成對試驗結(jié)果的誤判。為研究PTEN基因在兒童AL發(fā)病機制中的作用,本實驗構(gòu)建了PTEN基因的RNAi及其逃避RNAi策略結(jié)構(gòu)(RNA interference escape strategy construct,RESC)救援的慢病毒載體質(zhì)粒。應(yīng)用人T淋巴細胞(T Lymphocytes,T-LC)建立其陰性對照(T-LC-GFP)、PTEN基因敲減(T

5、-LC-shPTEN)和RESC救援(T-LC-rrshPTEN)細胞模型,通過對PTEN基因的敲減及RESC救援,觀察人T-LC中PTEN蛋白的表達及AKT通路的活化情況、細胞增殖和細胞周期的變化。應(yīng)用人主動脈內(nèi)皮細胞永生化細胞(HAEC-hT)建立其陰性對照(HAEC-hT-GFP)、PTEN基因敲減(HAEC-hT-shPTEN)和RESC救援(HAEC-hT-rrshPTEN)細胞模型,觀察人HAEC-hT遷移、損傷修復(fù)變化,并

6、檢測相關(guān)信號通路分子表達情況。本實驗旨在探討PTEN基因的生物學(xué)特性,及其下游信號分子與兒童AL發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。探討所構(gòu)建的RNAi及其RESC救援慢病毒載體系統(tǒng)在基因操作中的功能,及避免RNAi過程中脫靶效應(yīng)對實驗結(jié)果造成誤判的作用。
　　 目的:構(gòu)建人PTEN基因RNAi及其RESC救援的慢病毒載體并進行鑒定,為能有效的避免“脫靶效應(yīng)”所引起的假陽性結(jié)果對實驗的干擾、為研究PTEN基因功能提供穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染載體。
　　

7、 方法:
　　 1.構(gòu)建策略設(shè)計并合成1對己篩選確定的能表達PTEN基因RNAi的發(fā)央式RNA結(jié)構(gòu)(small or short hairpin RNA,shRNA)的單鏈寡核苷酸,中間添加loop環(huán)(TTCAAGAGA),每對寡核苷酸兩端分別帶有酶切位點以方便基因操作。該有效靶序列的特點是:GC含量在35％～55％,以堿基“G”開始,連續(xù)5個堿基“T”結(jié)束。oligo DNA經(jīng)退火形成雙鏈DNA后,將其定向克隆到載體pFLR

8、u-GFP質(zhì)粒的XbaI／XhoI酶切位點處,構(gòu)建成PTEN的RNAi慢病毒載體pFLRu-U6-shPTEN。在此基礎(chǔ)上根據(jù)密碼子簡并性引入RESC機制:在PTEN基因shRNA對應(yīng)的位置引入4個同義點突變,在核苷酸水平上改變基因,而其所表達的PTEN天然蛋白編碼不變,又使shRNA不能作用于這種“外源設(shè)計的mRNA”,從而允許救援?！巴庠丛O(shè)計的mRNA”兩端分別帶有酶切位點以方便基因操作。把這個基因片段與GFP報告基因融合后,定向克

9、隆到載體pFLRu-U6-shPTEN質(zhì)粒的EcoRI／BamHI酶切位點處,從而獲得人PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒載體pFLRu-U6-rrshPTEN。把這2個載體引入RNAi實驗中,如果能恢復(fù)由RNAi引起的變化,則可以排除因shRNA的脫靶效應(yīng)所引起的假陽性結(jié)果,從而避免對基因功能的誤判。
　　 2.PTEN基因RNAi慢病毒載體pFLRu-U6-shPTEN的構(gòu)建通過3個PCR反應(yīng)步驟分別擴增出:含hU6啟

10、動子(含XbaI酶切位點)的寡核苷酸片段(f1)、能使PTEN基因沉默的shRNA(含XhoI酶切位點)片段(f2)及U6-shPTEN片段(f3)。之后把f3作為插入片段,亞克隆到載體pFLRu-GFP質(zhì)粒的Xbal／XhoI酶切位點。經(jīng)細菌轉(zhuǎn)化,氨芐抗性篩選。陽性克隆提取質(zhì)粒；酶切及U6前引物測序驗證。在Genbank數(shù)據(jù)庫BLAST分析與其他基因的同源性。
　　 3.PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒載體pFLRu-

11、U6-rrshPTEN的構(gòu)建通過3個PCR反應(yīng)分別擴增出對應(yīng)shRNA位置有同義突變(含EcoRI酶切位點)大小為650bp的mRNA片段(F1)、大小為560bp(含BamHI酶切位點)的mRNA片段(F2)及含有4個同義突變的PTEN基因mRNA的全長片段(F3)。之后把與報告基因GFP融合的F3亞克隆到載體pFLRu-U6-shPTEN質(zhì)粒的EcoRI／BamHI酶切位點。經(jīng)細菌轉(zhuǎn)化、氨芐抗性篩選。陽性克隆提取質(zhì)粒；酶切及測序鑒定

12、。并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因進行比較。
　　 4.慢病毒的包裝和滴度測定293T細胞會合度達75％時,在TRANSIT介導(dǎo)下,使用慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G的混合物(按8:1混合),分別與慢病毒質(zhì)粒pFLRu-U6-shPTEN,pFLRu-U6-rrshPTEN共轉(zhuǎn)染293T細胞；轉(zhuǎn)染后48h,收獲上述2種慢病毒貯液。用NIH3T3細胞,采用逐孔梯度稀釋法(10-1～10-6)測定病毒滴

13、度。倒置熒光顯微鏡下檢測GFP表達量。
　　 結(jié)果:
　　 1.pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN基因片段擴增產(chǎn)物經(jīng)1％TAE瓊脂糖凝膠電泳,紫外線透射儀下觀察,在約420bp及1200bp處可見清晰條帶,與RNAi實驗要求的shRNA及目的基因PTEN的cDNA長度一致。
　　 2.pFLRu-U6-shPTEN經(jīng)3酶切,電泳后獲得預(yù)期大小的條帶。證實f3片段已插入pFLRu-G

14、FP載體中。經(jīng)DNA測序鑒定pFLRu-U6-shPTEN基因序列和預(yù)期基因序列完全一致。
　　 3.pFLRu-U6-rrshPTEN經(jīng)4酶切,電泳后獲得預(yù)期大小的條帶。證實F3片段已插入pFLRu-U6-shPTEN載體中。經(jīng)DNA測序鑒定pFLRu—U6-rrshPTEN目的基因序列在氨基酸水平上與基因庫的基因序列完全同源。
　　 4.用倒置熒光顯微鏡觀察已轉(zhuǎn)染的293T細胞,可見大部分包裝細胞發(fā)出綠色熒光。提示P

15、TEN基因RNAi慢病毒載體pFLRu-U6-shPTEN及其RESC救援慢病毒載體pFLRu-U6-rrshPTEN己成功構(gòu)建。經(jīng)過293T細胞擴增后,最終分別獲得6.0×105pfu／mL、5.0×105pfu／mL的病毒,能夠滿足后期的體內(nèi)外實驗。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒載體。為研究PTEN基因的功能提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞載體。
　　 目的：
　　 應(yīng)用

16、已成功構(gòu)建的人PTEN基因RNAi慢病毒載體及其RESC救援慢病毒載體感染人類正常T淋巴細胞(T-LC),建立PTEN基因敲減及其RESC救援的細胞模型；觀察PTEN基因敲減前后及RESC救援后人T-LC信號通路、細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的變化,為進一步研究淋巴細胞性白血病的發(fā)病機制提供基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.T-LC培養(yǎng)及純化健康人外周血由健康志愿者提供(所有志愿者均簽署知情同意書)。先制備外周血單個核細胞

17、(PMNC),再用免疫磁珠法純化出T-LC。應(yīng)用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 2.PTEN基因敲減及其RESC救援T-LC細胞模型的建立用pFLRu-GFP質(zhì)粒、shPTEN和rrshPTEN轉(zhuǎn)染T-LC,建立T-LC的陰性對照模型(T-LC-GFP)、PTEN基因敲減模型(T-LC-shPTEN)及其RESC救援模型(T-LC-rrshPTEN)等細胞模型。
　　 3.Western blot檢測

18、PTEN和pAKT蛋白的表達收獲、裂解細胞獲取總蛋白,取各組等量蛋白于聚丙烯酰胺凝膠中電泳,用PVDF膜轉(zhuǎn)膜、封膜、再加入PTEN、pAKT、AKT和β-actin抗體孵育、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光、攝片。應(yīng)用ImageJ共圖像處理軟件對Western blot結(jié)果進行量化分析。
　　 4.MTT法檢測PTEN基因敲減及RESC救援對T-LC生長的影響取T-LC、T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4

19、組的對數(shù)期細胞,細胞濃度為1×106／mL時,按200μL／孔接種于96孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,在培養(yǎng)第1、2、3、4、5 d時,分別取出一板,加MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4h,酶標(biāo)儀上測定各孔OD570nm值。
　　 5.流式細胞術(shù)檢測PTEN敲減及RESC救援對細胞周期及凋亡的影響將T-LC、T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4組細胞調(diào)整到5×105／50μL,10mg／mL RNaseA20μ

20、L,37℃作用30min,加入碘化丙錠(PI),用流式細胞儀檢測細胞周期。Annexin V／PI雙染法檢測細胞凋亡率。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SSPS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用方差分析及q檢驗,α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.用慢病毒載體pFLRu—GFP、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN感染染T—LC后,用

21、倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達情況,可見大部分T-LC在熒光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光,提示T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等細胞模型構(gòu)建成功。
　　 2.Western blot方法顯示:T-LC-GFP組PTEN基因的表達與T-LC組相比無明顯變化(P>0.05),T-LC-shPTEN組PTEN基因表達較T-LC組、T-LC-GFP組減弱(P<0.01),T-LC-rrshPTEN組,PTEN基因

22、(與GFP基因一起)又出現(xiàn)了表達,與T-LC-GFP組、T-LC-shPTEN組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T-LC細胞的陰性對照、PTEN基因敲減模型及RESC救援細胞模型T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN構(gòu)建成功。
　　 3.Western blot檢測pAKT蛋白的表達:與T-LC組和T-LC-GFP組細胞比較,T—LC-shPTEN組細胞pAKT的表達明顯增多(P<0.01

23、),而T—LC-rrshPTEN組細胞的pAKT則與前兩者相似(P>0.05),表明PTEN敲減后激活了T-LC中的PI3K／AKT信號通路,而RESC救援則又使PTEN基因敲減所引起的pAKT表達恢復(fù)到敲減之前的狀態(tài)。
　　 4.MTT法測量細胞生長曲線顯示:T-LC-shPTEN組細胞生長增快,與T-LC組和陰性對照細胞T-LC-GFP組相比,于第2天開始即有明顯差異(P<0.05)。而T-LC-rrshPTEN組細胞生長速

24、度與T—LC組和T-LC-GFP組相似(P>0.05),提示RESC救援能恢復(fù)PTEN基因抑制細胞生長的功能。
　　 5.流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化顯示:PTEN基因敲減后(T-LC-shPTEN組)G0／G1期細胞明顯減少,S期細胞明顯增加,G2／M期細胞增加,細胞凋亡減少。與其他3組細胞相比,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。RESC救援后(T-LC-rrshPTEN組),G0／G1期細胞、S期細胞和G2／M期細胞

25、及細胞凋亡情況又分別恢復(fù)。與T-LC組和T-LC-GFP組相比,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PTEN基因敲減后,T淋巴細胞在增殖能力、細胞周期、細胞凋亡、信號傳導(dǎo)通路等方面的生物學(xué)特性都有改變,PTEN基因在分子水平參與了兒童AL的發(fā)病機制。
　　 2.RESC救援慢病毒載體僅在核苷酸水平上改變基因,其所表達的PTEN天然蛋白編碼不變,實現(xiàn)真正意義的救援,避免了RNAi過程中脫靶效

26、應(yīng)副作用對實驗造成的影響,彌補了同類研究的遺漏與不足。
　　 目的：
　　 應(yīng)用已成功構(gòu)建的人PTEN基因RNAi及其RESC救援慢病毒載體感染人主動脈內(nèi)皮細胞的永生化細胞(HAEC-hT),建立其陰性對照(HAEC-hT-GFP)、PTEN基因敲減(HAEC-hT-shPTEN)和RESC救援(HAEC-hT—rrshPTEN)細胞模型,觀察人HAEC-hT遷移、損傷修復(fù)變化,并檢測相關(guān)信號通路分子表達情況。
　

27、　 方法：
　　 1.HAEC永生化及驗證HAEC購自Clonetics公司,由美國圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)實驗中心Mr.Longmore實驗室進行永生化(命名為HAEC-hT)處理并驗證后,用EGM完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
　　 2.PTEN基因敲減及其RESC救援HAEC-hT細胞模型的建立用pFLRu-GFP質(zhì)粒、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN轉(zhuǎn)染HAEC-hT,建立HAEC

28、-hT的陰性對照模型(HAEC-hT-GFP)、PTEN基因敲減模型(HAEC-hT-shPTEN)和PTEN基因RESC救援模型(HAEC-hT-rrshPTEN)等細胞模型。
　　 3.PTEN敲減及其RESC救援后HAEC-hT單個細胞遷移分析觀察在整個過程中未分裂、未與其他細胞接觸、未遷移到視野外的細胞,用Olympus X81倒置顯微鏡每4min拍照1次,連續(xù)12h。ImageJ軟件追蹤每個細胞的運動路徑。比較4組及加

29、入S1P、VEGF刺激后細胞不同時間遷移方向與速度。
　　 4.PTEN敲減及其RESC救援后HAEC-hT細胞創(chuàng)傷愈合試驗分析各組細胞乏血清培養(yǎng)2h后,制作大約230±32μm寬傷口(約移除49±7％的培養(yǎng)細胞)。用Olympus X71定時顯微鏡(10×)每隔5min拍照創(chuàng)傷愈合情況。創(chuàng)傷愈合率用ImageJ做定量分析。
　　 5.Western blot檢測 pAKT蛋白的表達取PTEN敲減及其RESC救援后HAE

30、C-hT細胞乏血清培養(yǎng)2h,隨后進行損傷,加或不加1μM／mL,的S1P、50ng／mL的VEGF,分別在0、15、30min時間點收獲細胞,用Western blot檢測pAKT蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.永生化的血管內(nèi)皮細胞形態(tài)和生長速度同原代培養(yǎng)細胞無差異,兩者對S1P、VEGF刺激具有相同反應(yīng)。
　　 2.2個對照組細胞形態(tài)均為梭形,細胞核具有明顯的兩極,細胞遷移是細胞板狀突起伸展、收縮引起外形

31、不斷變化,但朝向一極運動。PTEN敲減后的內(nèi)皮細胞體積變大,細胞形態(tài)趨向圓形,胞核形態(tài)改變不明顯。細胞運動速度增快(P<0.05),而且運動明顯缺乏方向性。RESC救援后的細胞不論從形態(tài),還是運動速度及運動的極向性均和對照組細胞無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.S1P、VEGF能夠明顯促進內(nèi)皮細胞的遷移及損傷修復(fù)(P<0.05)。但在PTEN敲減細胞中,S1P、VEGF刺激僅使得損傷修復(fù)速度少量增加(P>0.05)。

32、>　　 4.添加S1P、VEGF刺激后,對照組細胞中pAKT表達量隨著時間的延長均有所增加(P<0.05)。PTEN敲減組3個時間點pAKT表達量無明顯差異(P>0.05),但與對照組相比其表達量增加。在傷口修復(fù)過程中,S1P、VEGF的加入增加了pAKT蛋白的活性。RESCU救援后pAKT表達量與對照組相似。
　　 結(jié)論:
　　 1.PTEN的缺失使血管內(nèi)皮細胞失去極性運動的能力；由于缺乏趨向損傷部位方向性的運動,從