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文檔簡介
1、microRNA是一類長度在22nt左右的非編碼調(diào)控RNA,它們通過與靶基因mRNA的3'UTRs不同程度的互補結合,以降解mRNA和抑制翻譯兩種方式調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的基因表達,發(fā)揮轉錄后抑制的功能。生物信息學預測哺乳動物的microRNA能夠調(diào)節(jié)高達30%的編碼蛋白的基因,越來越多的證據(jù)表明microRNA在多種病理、生理條件下發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。在眾多microRNA中,miR-146a最早被證實為參與天然免疫的調(diào)控因子,在免疫反應和
2、炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。當LPS刺激和病毒感染時,miR-146a在多種細胞中發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)因子作用,在單核細胞、肺泡上皮細胞、神經(jīng)小膠質(zhì)細胞中通過作用其靶基因IRAK1/2和TRAF6,抑制Toll樣受體信號通路活性,發(fā)揮炎癥抑制因子的作用。在骨髓過繼傳輸重建免疫系統(tǒng)的小鼠體系中,miR-146a被報道通過下調(diào)靶基因FADD的表達,抑制T細胞凋亡和IL-2表達,參與白血病發(fā)病。而在miR-146a基因敲出小鼠中,由于miR-146a
3、的缺失導致調(diào)節(jié)性T細胞部分抑制功能異常,使其喪失對于STAT信號通路的抑制作用,IFN-γ表達升高,引起T細胞活化,發(fā)生自身免疫性疾病,結果揭示了miR-146a在Treg細胞發(fā)揮外周免疫耐受中的重要調(diào)節(jié)作用。以上研究都證明miR-146a在慢性炎癥和獲得性免疫的過程中,仿佛一個強大的“剎車片”,發(fā)揮著負反饋抑制的功能。
microRNA表達譜研究表明,當生理或病理的免疫反應過程中,miR-146a的表達水平有顯著變化。對比天
4、然B細胞或天然T細胞,miR-146a在終末分化的淋巴細胞亞群Tfh、Treg和GCB細胞之中顯著升高。另外我們在之前的臨床研究工作中發(fā)現(xiàn),類風濕性關節(jié)炎滑膜組織中的CD4+T細胞的miR-146a表達顯著高于健康對照,并且高表達的miR-146a水平與TNF-α的水平呈正相關。據(jù)文獻報道,在癌癥、Sj(o)gren綜合征和硬皮病等自身免疫性疾病中,miR-146a同樣呈現(xiàn)高表達。這些疾病之中miR-146a都處于高標達狀態(tài),而miR-
5、146a在天然免疫之中發(fā)揮負反饋的機制顯然無法準確解釋疾病慢性化和病理反應持續(xù)存在的這一現(xiàn)象。
為了在體研究miR-146a在慢性炎癥、自身免疫性疾病中發(fā)揮的準確作用,我們構建了高表達miR-146a的轉基因小鼠。我們采用注射高濃度慢病毒構建了miR-146a轉基因小鼠,通過PCR擴增轉基因小鼠基因組特有病毒載體片段,鑒定構建成功的轉基因小鼠F0代的4個小鼠。并且利用轉基因小鼠中eGFP與miR-146a同時表達的這一特性,通
6、過流式細胞儀快速鑒定小鼠外周血中eGFP的表達,從而快速的篩選、鑒定轉基因小鼠。利用此方法,我們可以快速鑒定轉基因陽性小鼠,并回交9代以上建立了穩(wěn)定品系。應用熒光定量PCR技術,我們分析了轉基因小鼠的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結等組織的miR-146a表達。定量PCR結果顯示,轉基因小鼠的miR-146a的表達水平高于野生型對照3-8倍,而這樣的表述水平與自身免疫性疾病中miR-146a表達水平近似,同時我們也排除了miR-146a*對轉
7、基因小鼠功能及表型影響的可能性。
miR-146a轉基因小鼠成功構建后,我們分析了其病理及免疫相關的表型。3周齡起,miR-146a轉基因小鼠出現(xiàn)脾臟和淋巴結腫大,在第4周差異最大達到8倍,而6周齡后保持在4倍左右。病理組織學的分析顯示早在8周齡,轉基因小鼠出現(xiàn)肺和肝臟的炎癥浸潤。先前有報道提示miR-146a可能參與血小板的形成,所以我們對轉基因小鼠進行全血血象分析,但是除了單個核細胞數(shù)量略高外,其它所有分析項目均與野生型小
8、鼠沒有顯著區(qū)別。
接下來我們進行了淋巴細胞各個亞群的分析。在T淋巴細胞亞群中,首先發(fā)現(xiàn)Treg細胞頻率略下降,但是T細胞(CD4+T和CD8+T)表面活化標志分析中(包括CD25,CD69,CD44和CD62L),并未發(fā)現(xiàn)T細胞活化。而其它T細胞亞群的表達頻率與野生型對照無顯著差異,胸腺內(nèi)T細胞發(fā)育也正常。說明Treg細胞的頻率降低,還不足以誘導T細胞活化。另外一個T淋巴細胞的重要發(fā)現(xiàn)是,轉基因小鼠脾臟中發(fā)現(xiàn)顯著升高的雙陰性T
9、細胞(CD3+CD4-CD8-TCRβ+,doublenegativeT,DNT),并且這一現(xiàn)象在8-52周齡小鼠中均有發(fā)現(xiàn)。
miR-146a轉基因小鼠中發(fā)現(xiàn):DNT細胞增加,淋巴結、脾臟腫大,肝、肺炎性浸潤,而且這些病理表象皆在低齡小鼠中發(fā)現(xiàn),這一系列的病理表象與人類自身免疫性淋巴增生綜合征(autoimmunelymphoproliferativesymdrome,ALPS)十分相像。按照ALPS的臨床表現(xiàn)之一IL-10
10、等細胞因子、血清免疫球蛋白也會相應增高。所以我們使用MILLIPLEX方法測定轉基因小鼠血清中32種細胞因子和趨化因子表達。結果顯示8周齡轉基因小鼠中血清中免疫球蛋白IgG1,IgG2a,IgG2b和IgG3顯著高于同年齡野生型小鼠,但是當小鼠年齡到達52周齡時,雖然IgG1和IgG2a仍高于野生型對照,但IgG2b,IgG3已經(jīng)恢復。而血清中32種細胞因子和趨化因子,血清IgM和IgA在轉基因和野生型8-52周齡小鼠之間并無顯著差異。
11、
與血清IgG升高水平一致,B淋巴細胞(B220+)數(shù)量顯著增高,但表達頻率并無顯著變化,同時我們檢測B淋巴細胞其它亞群也無顯著區(qū)別,包括成熟B細胞(B220+AA4.1)、未成熟的B細胞(B220+AA4.1+)、新形成的或活化的B細胞(B220+IgM+CD21lowCD23low)、濾泡B細胞(B220+IgM+CD21intCD23high),骨髓中B細胞發(fā)育也正常。然而,當我們將增大的淋巴結進行常規(guī)病理發(fā)現(xiàn)在淋巴結中
12、有許多疑似生發(fā)中心的結構,進一步的免疫組織化(PNA染色)證實最早在8周齡轉基因小鼠中檢測到大量自發(fā)生發(fā)中心結構,同時免疫熒光共聚焦分析也得到了一致的結果。這一現(xiàn)象提示我們馬上檢測與之生發(fā)中心形成相關的Tfh和GCB細胞,結果發(fā)現(xiàn)轉基因和野生型小鼠之間Tfh細胞比例沒有顯著的差異;而在8-52周齡的轉基因小鼠中的淋巴結、腸系膜淋巴結、PP體、脾臟等外周淋巴器官中,都發(fā)現(xiàn)GCB細胞的比例顯著升高。
綜上所述,在miR-146a轉
13、基因小鼠中發(fā)現(xiàn)脾臟和淋巴結腫大,肝臟、肺部炎癥浸潤,DNT細胞累積,血清IgG升高,GCB細胞增多,并且這些病理表型發(fā)病較早,隨年齡增長有一定的緩解。綜上所述轉基因小鼠的這些病理表征與人類自免性淋巴增生綜合征的臨床表現(xiàn)一致,說明我們構建的miR-146a轉基因小鼠自發(fā)形成ALPS。
自免性淋巴增生綜合征的主要致病因素就是Fas基因突變和蛋白表達不足,F(xiàn)as介導的凋亡通路異常。為此,我們分析了野生小鼠及miR-146a轉基因小鼠
14、多個淋巴細胞亞群中Fas的表達。在生理條件下,野生型小鼠體內(nèi)Fas只在GCB細胞之中高表達,而上調(diào)miR-146a只在GCB細胞內(nèi)顯著下調(diào)了Fas的蛋白表達,對其它細胞亞群中的Fas表達并無影響。生物信息學分析顯示,在人、大鼠和小鼠3個種屬內(nèi),miR-146a的種子區(qū)與Fas的3'UTR大體互補,提示Fas是miR-146a的潛在靶基因。我們使用熒光素酶報告基因法分析miR-146a的靶基因,共轉染編碼miR-146a和Fas的3'UT
15、R區(qū)域的質(zhì)粒于293FT細胞中,分析結果證實Fas是miR-146a的直接靶基因。為了進一步證明了miR-146a靶向Fas基因下調(diào)其表達是特異性發(fā)生在生發(fā)中心形成過程中,而不是源于B細胞發(fā)育過程中的影響。我們分離miR-146轉基因或野生型小鼠的non-GCB細胞,分別混合野生型型CD4+T細胞,然后過繼轉移到SCID小鼠,7天后檢測來源于供體小鼠non-GCB細胞所形成GCB細胞的百分比及新生成GCB細胞之中Fas的表達。結果顯示來
16、源于轉基因小鼠的新形成的GCB細胞比例(27-42%)顯著高于來源于野生型的的GCB細胞比例(4-16%)。而相應的來源于轉基因小鼠的GCB細胞中Fas表達顯著低于野生型來源。以上結果說明,F(xiàn)as是miR-146a在GCB細胞中的靶基因,而且其抑制作用特異性發(fā)生在生發(fā)中心形成過程中。
為了進一步闡明miR-146a的介導B細胞功能障礙的機制,我們分離野生型和轉基因小鼠的天然B細胞,應用cDNA表達譜芯片研究miR-146a在B
17、細胞中的靶基因,將基因芯片得到的原始數(shù)據(jù)進行Sylamer分析,進而分析相關信號通路。將miR-146a的種子區(qū)的兩個結構域與mRNA表達下調(diào)基因的3'端非編碼區(qū)進行富集比對,發(fā)現(xiàn)這些能與miR-146a種子區(qū)互補配對的基因主要集中在轉基因B細胞中。將得到的差異基因進行信號通路分析,發(fā)現(xiàn)主要集中在NF-κB,AP-1,IRF和STAT幾個信號通路中,先前已經(jīng)被確認的TRAF6,IRAK1和CXCR4在我們的實驗中再次得到驗證。而這些結果
18、與我們體外B細胞增殖實驗一致,即在LPS刺激下,miR-146a高表達抑制了B細胞增殖。說明miR-146a通過抑制NF-κB信號通路,發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用同樣適用于B細胞。
轉基因小鼠體內(nèi)大量增殖的天然B細胞可以用淋巴細胞穩(wěn)態(tài)增殖的機制來解釋。為了驗證這一假設,我們分離轉基因和野生型小鼠的天然B細胞或CD4+T細胞,將其過繼傳輸?shù)矫庖呷毕莸腟CID受體小鼠體內(nèi),用EdU摻入法檢測淋巴細胞的穩(wěn)態(tài)增殖情況。在過繼傳輸?shù)?天后,我們
19、發(fā)現(xiàn)來源于轉基因小鼠的天然B細胞增殖情況顯著高于來源于野生小鼠的B天然細胞,但是CD4+T細胞二者之間沒有顯著差異,同時我們還發(fā)現(xiàn)高表達miR-146a的B細胞可以促進T細胞的穩(wěn)態(tài)增殖。結果揭示B細胞中持續(xù)表達的miR-146a促進B細胞和T細胞的穩(wěn)態(tài)增殖,這些發(fā)現(xiàn)為ALPS發(fā)病機制提供了一種新解釋。
大多數(shù)的ALPS患者表現(xiàn)為在幼年即出現(xiàn)非惡性淋巴結腫大及脾腫大,顯著增加雙陰性性T細胞,和較高的血清IgG水平。所有病理表型在
20、年幼時病情嚴重,而隨著年齡增長病情在一定程度上得以緩解。miR-146a轉基因小鼠三周齡即出現(xiàn)脾臟和淋巴結腫大,生后的第四周達到頂峰。所有年輕的轉基因小鼠的脾臟中都觀察到雙陰性T細胞增高。8周齡轉基因小鼠血清IgG1,IgG2b,IgG2a和IgG3的濃度高出野生型對照3-6倍,而52周齡時已經(jīng)有部分緩解。臨床上4-5%的ALPS患者存在肺部浸潤性病變和肝功能障礙,而miR-146轉基因小鼠肺和肝臟炎癥細胞浸潤發(fā)病率極高。另外,ALPS
21、患者易患霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤,而我們的轉基因小鼠老年腫瘤發(fā)病率達到20%以上(結果未出示)。不過,miR-146轉基因小鼠與ALPS患者診斷標準之間也有很大區(qū)別,25%的ALPS患者體內(nèi)可檢測到自身抗體,miR-146轉基因小鼠血清檢測不到自身抗體。此外,IL-10顯著增加也是ALPS患者的典型臨床表現(xiàn),而我們分析了血清中32種細胞因子和趨化因子都沒有顯著的改變。這些數(shù)據(jù)說明,單獨改變一個microRNA(miR-146a)的表
22、達,并沒有打破小鼠體內(nèi)的免疫耐受狀態(tài),而主要是促進了淋巴細胞穩(wěn)態(tài)增殖,而ALPS的發(fā)病還需要諸如Fas等基因突變的累積,典型ALPS患者遺傳缺陷主要發(fā)生在凋亡通路,會直接打破淋巴細胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受。有報道顯示Fas基因突變和蛋白表達不足是ALPS發(fā)病的主要原因。本研究中,我們證實了高表達miR-146a下調(diào)了GCB細胞內(nèi)的Fas表達,最終導致轉基因小鼠形成ALPS病理表癥。
在我們轉基因小鼠研究模型中,ALPS的致病因子似乎是
23、高表達的miR-146a的天然B細胞。而且天然B細胞的穩(wěn)態(tài)增殖可以促進T細胞的增殖,天然B細胞表面Fas表達下降,使得其更易于轉化為GCB細胞。這些發(fā)現(xiàn)結合先前的研究揭示,在GCB細胞內(nèi)特異地下調(diào)Fas表達,會使淋巴細胞穩(wěn)態(tài)失衡而導致淋巴細胞過度增生。我們推測GCB細胞內(nèi)下調(diào)Fas表達,還可促進成熟T細胞的存活,使得活化T細胞易于丟失CD4或CD8的共受體,因此導致DNT細胞累積。有研究表明慢性活化性EB病毒感染患者呈現(xiàn)出ALPS患者的
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