擬穴青蟹SpALF6和SpALF7的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、抗脂多糖因子（Anti-lipopolysaccharide factor,ALF）是甲殼動(dòng)物體內(nèi)主要的抗菌肽分子，屬于陽(yáng)離子抗菌肽家族。該家族抗菌肽具有序列和功能多樣性的特點(diǎn)，在抗細(xì)菌、真菌、病毒等免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前，對(duì)于該類(lèi)抗菌肽如何通過(guò)序列的多樣性影響其功能的多樣性，仍缺乏足夠的了解。本研究論文從擬穴青蟹體內(nèi)鑒定了2種非典型的抗脂多糖因子成員，通過(guò)序列分析和功能研究，初步闡明了ALF家族成員序列多樣性和其免疫功能的關(guān)系，

2、揭示了序列多樣性對(duì)功能多樣的性的影響規(guī)律。
　　我們研究首先從擬穴青蟹體內(nèi)鑒定了SpALF6及其變異體SpALF6-V。與該家族大多成員蛋白屬于陽(yáng)離子抗菌肽不同，SpALF6的pI值為6.79，其LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD（LPS-binding domain）pI值為6.05，屬于非典型的ALF家族成員，而其自然界中變異體SpALF6-V的pI值卻為7.98，屬于陽(yáng)離子抗菌肽。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這個(gè)變異體的產(chǎn)生是源于特定位點(diǎn)單核苷

3、酸多態(tài)性（SNP）。為了研究SNP位點(diǎn)的存在對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，我們對(duì)這兩個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)氨基酸的突變分別是SpALF6成熟肽的LBD附近帶正電荷組氨酸突變成高電荷精氨酸（H46突變?yōu)镽），遠(yuǎn)離LBD的丙氨酸突變成了脯氨酸（A110突變?yōu)镻）。由于丙氨酸和脯氨酸都不帶電荷，而且遠(yuǎn)離LPS結(jié)合域，因此我們認(rèn)為突變體SpALF6-V與SpALF6的性質(zhì)功能上的差異可能是由組氨酸的突變導(dǎo)致的，因此為了研究這兩種抗菌肽功能

4、上的差異，我們通過(guò)人工定點(diǎn)突變的技術(shù)僅將組氨酸突變成了精氨酸獲得了SpALF6的人工突變體來(lái)模擬SpALF6-V的功能，命名為SpALF6-M。首先我們進(jìn)行了SpALF6在體內(nèi)組織分布和表達(dá)模式研究。隨后我們進(jìn)行了SpALF6、SpALF6-M體外抑菌實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及微生物表面主要病原相關(guān)分子模式結(jié)合實(shí)驗(yàn)比較研究。此外，我們也人工合成了SpALF6的LBD肽對(duì)其保守區(qū)進(jìn)行了抑菌活性和微生物表面多糖結(jié)合研究。組織分布和表達(dá)模式研究結(jié)

5、果表明，SpALF6主要是在血淋巴中表達(dá)，副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌免疫刺激青蟹后可以導(dǎo)致SpALF6的上調(diào)表達(dá)，暗示SpALF6可能參與到了抑菌免疫應(yīng)答。與SpALF6相比，SpALF6-M表現(xiàn)出了更強(qiáng)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌作用以及細(xì)菌結(jié)合活性。同時(shí)，SpALF6-M也表現(xiàn)出了更強(qiáng)的LTA的結(jié)合活性，暗示SpAFL6-LBD外部且距離該結(jié)構(gòu)域較近的特定氨基酸的能協(xié)助增強(qiáng)蛋白的抗菌作用。SpAFL6-LBD肽的功能研究結(jié)果表明，SpAFL

6、6-LBD肽可以結(jié)合LPS、LTA、PGN等多糖，而且活性更強(qiáng)，表明該保守區(qū)域仍是活性中心，但是該陰離子短肽并沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌作用，暗示著其發(fā)揮抑菌作用仍需要LBD附近的氨基酸參與。
　　我們研究還鑒定了SpALF7，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典的ALF蛋白家族具有3個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，并且依靠2個(gè)半胱氨酸形成1個(gè)二硫鍵維持核心功能域的三維結(jié)構(gòu)不同，蛋白序列及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，SpALF7只含有2個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，并且該

7、序列含有4個(gè)半胱氨酸，可能形成2個(gè)二硫鍵。對(duì)其組織分布和抗菌功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SpALF7主要表達(dá)在血細(xì)胞；重組蛋白SpALF7體外抑菌功能研究發(fā)現(xiàn)SpALF7對(duì)除嗜水氣單孢菌以外革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及真菌生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用。SpALF7的細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SpALF7與副溶血弧菌、酵母菌和氣單胞菌結(jié)合活性較強(qiáng)，而與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠球菌結(jié)合活性較弱。微生物多糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，SpALF7可結(jié)合LP

8、S，對(duì)金黃色葡萄球菌PGN、LTA和真核生物細(xì)胞壁組分β-葡聚糖也有一定的結(jié)合活性，暗示SpALF7的抗菌功能與其糖結(jié)合能力密切相關(guān)，可能利用與特定糖組分的結(jié)合，促進(jìn)隨后的抑菌功能。
　　通過(guò)上述研究，本論文明確了SpALF6和SpALF7在青蟹免疫體系中發(fā)揮重要作用，闡明了兩個(gè)抗菌肽的主要序列特征、抗菌特性及可能的抗菌機(jī)理，進(jìn)一步揭示了ALF類(lèi)分子抗菌活性與序列多態(tài)性之間的關(guān)系，具有重要的理論價(jià)值。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SpALF6