抗PD-L1單克隆抗體聯(lián)合5-氮雜胞苷對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE450治療的研究.pdf

1、目的：表觀治療藥物5-氮雜胞苷（5-Azacytidine，5-Aza）聯(lián)合抗PD-L1（programmed death ligand1）單抗對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE450進(jìn)行免疫和表觀治療，探討表觀治療藥物5-Aza對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE450的PD-L1蛋白表達(dá)變化，以及聯(lián)合單克隆抗體治療對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE450基因、蛋白表達(dá)和生長(zhǎng)狀態(tài)之間的關(guān)系。檢測(cè)PD-L1(programmed death ligand1)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移

2、酶1(DNAmethyltransferases1，DNMT1)的表達(dá)在食管癌細(xì)胞株KYSE450生長(zhǎng)狀態(tài)改變情況。
　　方法：⑴采用5-Aza治療食管癌細(xì)胞株KYSE450，蛋白印記雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)，觀察5-Aza藥物治療后對(duì)腫瘤細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)變化。⑵建立體外誘導(dǎo)腫瘤特異性淋巴細(xì)胞與KYSE450食管癌細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，觀察模擬體外免疫系統(tǒng)5-Aza藥物與抗PD-L1單抗聯(lián)合的作用進(jìn)行分析。⑶應(yīng)用甲

3、基化特異性PCR檢測(cè)DNMT1基因和PD-L1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)改變情況。⑷應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)用藥治療后DNMT1基因和PD-L1基因mRNA的表達(dá)改變。⑸應(yīng)用Western blot檢測(cè)用藥后各組DNMT1基因和PD-L1基因蛋白表達(dá)改變。⑹應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞外分泌的PD-L1蛋白變化。⑺細(xì)胞劃痕試驗(yàn)鑒定KYSE450食管癌細(xì)胞株的細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果：①5-Aza治療KYSE450食管癌細(xì)胞72

4、h后，PD-L1蛋白表達(dá)增加。②成熟的DC細(xì)胞與KYSE450食管癌細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)可見二者相互結(jié)合。③治療組的DNMT1、PD-L1基因蛋白、甲基化表達(dá)比對(duì)照組低，DNMT1呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。④QRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組5-Aza處理后的PD-L1的mRNA表達(dá)比對(duì)照組高，抗體組與混合組均比對(duì)照組表達(dá)低。⑤Western blot結(jié)果顯示，藥物治療組的DNMT1蛋白表達(dá)比對(duì)照組低，5-Aza治療組的PD-L1蛋白比對(duì)照組明顯增高，抗體

5、組與混合組均比對(duì)照組表達(dá)低。⑥比較各組細(xì)胞上清中的PD-L1水平，各治療組的濃度明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。⑦細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥治療后對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE450的細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力有明顯下降作用。
　　結(jié)論：⑴5-Aza治療KYSE450細(xì)胞可使PD-1/PD-L1信號(hào)通路增強(qiáng)。⑵表觀藥物5-Aza聯(lián)合抗PD-L1單抗治療時(shí)，在腫瘤特異性CTL的作用下對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲較單一治療明顯抑制。⑶抗PD-L1抗體聯(lián)

6、合甲基化抑制劑對(duì)體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞與KYSE450抗原負(fù)載作用下的PD-L1蛋白表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平、PD-L1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響及細(xì)胞分泌蛋白、侵襲、轉(zhuǎn)移能力有著密切的相關(guān)。⑷抗PD-L1單抗進(jìn)行免疫治療有效的同時(shí)可能會(huì)引起非DNA序列改變，使細(xì)胞株呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，使細(xì)胞基因重編程序或者提升T細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮。⑸抗體治療聯(lián)合5-Aza進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在T淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)中起著調(diào)控作用，可使外周血T細(xì)胞DN