LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株和單克隆抗體的研制及其對T細胞的共刺激效應(yīng).pdf

1、正性與負(fù)性共信號分子共同參與，實現(xiàn)了對T細胞有效和適度免疫應(yīng)答的精確調(diào)控作用。共信號分子根據(jù)結(jié)構(gòu)主要分為免疫球蛋白（CD28/B7）超家族、腫瘤壞死因子（TNF/TNFR）超家族以及細胞因子超家族。人LIGHT（TNFSF14）屬于TNF家族成員，其與TNFR超家族受體分子HVEM作用可介導(dǎo)促進T細胞活化與增殖的正性共刺激信號。近期研究表明，HVEM也可作為配體與免疫球蛋白超家族成員BTLA或CD160作用介導(dǎo)對T細胞的抑制作用，并且相

2、關(guān)研究揭示了HVEM/LIGHT和BTLA（CD160）/HVEM間也存在信號的雙向性。因此，LIGHT/HVEM/BTLA（CD160）構(gòu)成了共信號分子中一個微觀的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，探討和分析LIGHT/HVEM信號的特性及其對T細胞的共刺激作用與機制具有重要的理論意義。
　　 本研究旨在建立L929/LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株，以此為手段探討人LIGHT分子體外對T細胞的共刺激效應(yīng)，通過制備鼠抗人LIGHT單克隆抗體和人HVEMI

3、g融合蛋白，分析其對LIGHT/HVEM效應(yīng)的阻斷，從而為闡明LIGHT/HVEM信號對T細胞的協(xié)同刺激作用與機制，進一步深入探討LIGHT/HVEM/BTLA（CD160）對T細胞復(fù)雜的調(diào)控機理提供有價值的實驗數(shù)據(jù)。
　　 一.人LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其對T細胞的共刺激作用。
　　 RT-PCR從經(jīng)PHA活化的T細胞中克隆人LIGHT編碼區(qū)全長基因，雙酶切后插入真核表達載體pIRES2-EGFP構(gòu)建重組子pI

4、RES2-EGFP-LIGHT，測序正確。脂質(zhì)體法以重組表達載體轉(zhuǎn)染小鼠L929細胞。G418加壓篩選并經(jīng)過數(shù)次亞克隆，建立了L929/LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，L929/LIGHT細胞膜上能穩(wěn)定高表達人LIGHT分子；體外細胞共培養(yǎng)試驗表明，與未轉(zhuǎn)染MGHT基因的L929/mock細胞相比，L929/LIGHT可顯著地促進抗人CD3單抗（mAb）刺激的T細胞增殖；同時L929/LIGHT亦能明顯促進T細胞對IL

5、-2、IFN-γ和IL-10的分泌。
　　 二.鼠抗人LIGHT單抗和人HVEMIg融合蛋白的研制及其生物學(xué)特性。
　　 1.以L929/LIGHT細胞為免疫原免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞。以L929/LIGHT為陽性篩選細胞，L929/mock作陰性對照，F(xiàn)ACS分析篩選陽性克隆，經(jīng)過4次亞克隆化培養(yǎng)，最終得到一

6、株持續(xù)分泌抗人LIGHT單克隆抗體的雜交瘤細胞株（7A8），經(jīng)快速定性試紙條分析法結(jié)果顯示，單抗7A8重鏈屬于IgG2b，輕鏈為κ。體外長期培養(yǎng)和液氮凍存后，復(fù)蘇的雜交瘤細胞生長狀態(tài)良好，穩(wěn)定分泌抗體；2.將人IgG（Fc）基因編碼區(qū)基因與人HVEM胞外段基因融合，按照構(gòu)建L929/LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞的技術(shù)和方法將HVEMIg融合基因?qū)胝婧思毎?，篩選并亞克隆獲得CHO/HVEMIg轉(zhuǎn)染細胞。利用流式細胞術(shù)、SDS-PAGE和Wes

7、tern-blot進行鑒定，結(jié)果顯示，HVEMIg融合蛋白分泌表達于CHO/HVEMIg基因轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清中。大規(guī)模細胞培養(yǎng)后再濃縮上清，通過protein G親和層析技術(shù)獲得純品HVEMIg融合蛋白，流式檢測結(jié)果，純化的蛋白與其配體LIGH工具有良好的結(jié)合能力。T細胞體外增殖實驗表明，抗LIGHT單抗和HVEMIg融合蛋白的加入可部分阻斷由基因轉(zhuǎn)染細胞協(xié)同CD3mAb對T細胞增殖的促進作用，并下調(diào)細胞因子的分泌。由此提示LIGHT

8、/HVEM通過介導(dǎo)正性共刺激作用參與活化T細胞的調(diào)節(jié)。
　　 綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了L929/LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株，該轉(zhuǎn)染細胞表達的膜型人LIGHT對T細胞體外增殖和細胞因子分泌具有顯著的促進作用；成功地研制一株鼠抗人LIGHT單抗7A8和HVEMIg融合蛋白。T細胞體外增殖試驗顯示，單抗7A8和HVEMIg對L929/LIGHT介導(dǎo)的刺激T細胞增殖和細胞因子分泌分別具有部分阻斷作用，單抗7A8為鼠抗人LIGHT的阻斷型