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文檔簡介
1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)對集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害嚴(yán)重,同時對養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。馬鏈球菌獸疫亞種的類M蛋白是一種重要的表面蛋白和毒力因子,具有調(diào)理素功能,且能夠抵抗抗體的吞噬細(xì)胞對其的吞噬作用。本試驗在分子水平上對馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的粘附機(jī)制進(jìn)行了研究,為該菌的致病機(jī)制及引起的豬鏈球菌病的防控進(jìn)行了有益的探索。 根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌
2、獸疫亞種豬源ATCC35246株的類M蛋白基因序列,設(shè)計和合成一對引物,并以ATCC35246株的基因組DNA為模板,通過PCR技術(shù),擴(kuò)增出去掉信號肽的類M蛋白基因并定向克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)中。重組質(zhì)粒通過酶切鑒定和測序后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá),SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物約60kD,Western blot顯示,其與ATCC35246株多克隆抗血清反應(yīng),抗原性良好。 以His親和層析拄純化
3、重組的類M蛋白作為抗原免疫6~8周齡的BALB/c小鼠,三次免疫后,取脾細(xì)胞并與對數(shù)期生長良好的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,應(yīng)用滅活的ATCC35246菌液為包被抗原,建立間接EIASA篩選陽性克隆,經(jīng)過3次亞克隆之后得到12株穩(wěn)定分泌抗類M蛋白單抗的細(xì)胞株,特異性檢測顯示其與豬鏈球菌2型等沒有交叉反應(yīng)。以BABL/c小鼠制備的腹水單抗,ELISA效價約為1:10000。 采用通用的模式細(xì)胞HEp-2細(xì)胞,研究馬鏈球菌獸疫亞種ATC
4、C35246株類M蛋白的粘附作用。結(jié)果顯示,ATCC35246株可以粘附HEp-2細(xì)胞,它可以粘附細(xì)胞。用重組的類M蛋白預(yù)處理HEp-2細(xì)胞,當(dāng)類M蛋白的量達(dá)到160μg/500μL,可以完全抑制細(xì)胞對細(xì)菌的粘附;用重組表達(dá)的類M蛋白鼠單抗血清處理ATCC35246,可抑制其對HEp-2細(xì)胞的粘附,在1:200倍稀釋時即能完全抑制它對HEp-2細(xì)胞的粘附:而ATCC35246的全菌鼠抗血清在1:200時能完全抑制它對HEp-2細(xì)胞的粘附
5、。同時,以12株單抗處理細(xì)菌以后,發(fā)現(xiàn)單抗2C8具有明顯抑制細(xì)胞粘附的作用,說明2C8對應(yīng)的抗原表位在細(xì)胞粘附中具有決定性作用。 以類M蛋白的單抗細(xì)胞株2C8分泌的單抗作為靶分子,研究其對應(yīng)的抗原表位。用從前以試驗得到的2C8單抗包被酶標(biāo)條孔,從12肽隨機(jī)肽庫中經(jīng)過5輪生物淘洗(結(jié)合、淘洗及富集)程序進(jìn)行篩選,第2輪以后降低2C8的包被濃度,同時升高洗液中吐溫-20的濃度。經(jīng)5輪親和篩選后,噬菌體的回收率從1.71×10<'-6
6、>增加到3.39×10<'-4>假陽性率逐輪降低,由20.31%降至0.22%,表明陽性克隆得到了有效富集。從第5輪篩選出的陽性克隆中隨機(jī)挑取14個進(jìn)行擴(kuò)增,然后對這些克隆采用ELISA和競爭ELISA來鑒定其結(jié)合性和特異性,發(fā)現(xiàn)10個克隆有較強(qiáng)的結(jié)合力而不與其它單克隆抗體反應(yīng)。然后對這10個克隆進(jìn)行測序。結(jié)果表明,所挑選的14個克隆均與單抗2C8有較強(qiáng)的結(jié)合性,其中10個克隆能夠發(fā)生較強(qiáng)抑制作用;從所測10個克隆的氨基酸序列分析,“S
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