馬鏈球菌獸疫亞種差異表達基因的鑒定及生物被膜態(tài)蛋白組學(xué)分析.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）是我國豬鏈球菌病的主要病原之一，可引起豬的敗血癥、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等，人食用被該菌污染的食物或是與患病動物密切接觸亦可感染。本文利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)技術(shù)對SEZ在感染豬肺組織中和生物被膜態(tài)的差異表達基因進行了鑒定;對SEZ在以上兩種狀態(tài)下均出現(xiàn)差異表達的纖連蛋白結(jié)合蛋白(Fibronectin-binding protein

2、，F(xiàn)NZ)基因進行了生物學(xué)功能分析;同時通過在體外建立生物被膜模型，比較了該菌生物被膜態(tài)與浮游態(tài)蛋白表達的差異。以上研究結(jié)果有助于闡明該病原菌的致病機理。
　　1.馬鏈球菌獸疫亞種在感染豬肺組織中差異表達基因的鑒定
　　病原菌在宿主體內(nèi)定殖與感染的過程是一個復(fù)雜的、動態(tài)的多因素作用過程，在這個過程中病原菌需要通過調(diào)控各基因的表達來適應(yīng)環(huán)境的變化。揭示SEZ在感染過程中基因的差異表達情況，有助于了解SEZ在宿主體內(nèi)的存活、增殖

3、以及對宿主的致病機制。然而，SEZ在感染宿主體內(nèi)的基因差異表達情況目前卻未可知。本研究利用SCOTS技術(shù)對SEZ在感染豬肺組織中差異表達基因進行了篩選，并通過dot blot和Real-time PCR對差異表達基因進行驗證，鑒定出45個差異表達基因。根據(jù)基因功能，45個基因可分為六類:代謝、細胞壁合成、應(yīng)激、轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄以及未知功能。以上結(jié)果有助于深化對SEZ在體內(nèi)感染狀態(tài)下基因差異表達情況的認識。
　　2.馬鏈球菌獸疫亞種生物被

4、膜態(tài)差異表達基因的鑒定
　　生物被膜是細菌黏附于非生物或活性組織表面的一種微生物聚集群體，在細菌持續(xù)性感染過程中起重要作用。SEZ能否形成生物被膜？SEZ生物被膜狀態(tài)下基因的表達情況如何目前均未見報道。本研究利用96孔微孔板法在體外建立了SEZ生物被膜模型，觀察到了生物被膜形態(tài)。利用SCOTS技術(shù)對SEZ生物被膜態(tài)的差異表達基因進行了篩選，并通過dot blot和Real-time PCR對差異表達基因進行驗證，鑒定出31個差異表

5、達基因。根據(jù)基因功能，31個基因可分為代謝、細胞壁合成、應(yīng)激、轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及未知功能七類。以上研究豐富了生物被膜形成機制的認識，有助于進一步研究該菌持續(xù)性感染的致病機理。
　　3.馬鏈球菌獸疫亞種FNZ基因功能分析
　　纖連蛋白結(jié)合蛋白基因(Fibronectin-binding protein，F(xiàn)NZ)是在感染豬肺組織和生物被膜態(tài)兩種條件下均出現(xiàn)表達差異的基因，該基因在SEZ致病過程中的具體作用有待深入研究。利用溫度

6、敏感型穿梭自殺質(zhì)粒載體pSET4s敲除SEZ ATCC35246的FNZ基因，構(gòu)建了FNZ基因缺失株ΔFNZ;利用穿梭載體pSET2構(gòu)建了互補株CΔFNZ。比較缺失株、互補株和野生株在細胞粘附、生物被膜形成能力、全血中的存活能力和毒力的差異，結(jié)果顯示ΔFNZ和CΔFNZ具有較好的遺傳穩(wěn)定性;ΔFNZ粘附HEp-2細胞、形成生物被膜及在全血中的存活能力均下降;ΔFNZ對小鼠的LD50較野生株高10倍，在小鼠血液、肝臟、肺臟和脾臟組織的活菌

7、數(shù)也有所下降。以上研究結(jié)果表明FNZ與SEZ的生物被膜形成、細胞粘附和致病性相關(guān)。
　　4.FNZ與FN結(jié)合部位的確定
　　文獻報道，纖連蛋白結(jié)合蛋白(Fibronectin-binding protein，F(xiàn)NZ)從N-端開始315個aa（約占50％）具有結(jié)合FN的活性，但具體結(jié)合位置未見報道。五個FNZ基因片段N1(amino acids 38-197),N2(amino acids 38-603),N3(amino a

8、cids 41-315),N4(amino acids 192-370)和N5(amino acids 38-225)在大腸桿菌中融合表達，并利用配基印跡結(jié)合試驗和ELISA檢測各融合蛋白對FN的結(jié)合能力。結(jié)果表明，F(xiàn)NZ在N端192-225aa區(qū)域為具有FN結(jié)合活性的線性部位。
　　5.馬鏈球菌獸疫亞種生物被膜態(tài)和浮游態(tài)比較蛋白組學(xué)分析
　　多種細菌生物被膜態(tài)的蛋白表達水平與浮游態(tài)之間存在差異，這些蛋白表達的差異可能與細菌

9、導(dǎo)致的持續(xù)性感染相關(guān)。SEZ能夠在體外形成生物被膜，但生物被膜狀態(tài)下的蛋白表達水平差異還未可知。利用比較蛋白組學(xué)方法，分析了SEZ生物被膜態(tài)與浮游態(tài)全菌蛋白的表達差異。結(jié)果表明，在生物被膜態(tài)13個蛋白的表達水平上調(diào)，主要與代謝、粘附和應(yīng)激相關(guān);11個蛋白的表達水平下調(diào)，主要與蛋白合成等相關(guān)。該結(jié)果有利于進一步闡明生物被膜的形成機制。
　　6.生物被膜態(tài)馬鏈球菌獸疫亞種免疫蛋白組學(xué)分析
　　采用感染豬的康復(fù)血清，對生物被膜態(tài)的

10、全菌蛋白進行了免疫蛋白組學(xué)分析。結(jié)果鑒定出17種能與康復(fù)血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白，其中8種蛋白為首次報道，另外9種蛋白在生物被膜態(tài)和浮游態(tài)均能與康復(fù)血清發(fā)生免疫反應(yīng)。從兩種狀態(tài)下均具有免疫反應(yīng)性的9種蛋白中選取3種蛋白holA、GroEL和ykgC進行克隆表達，并進行免疫保護評價，發(fā)現(xiàn)3種重組蛋白均能與SEZ感染豬的康復(fù)血清反應(yīng)，對小鼠的免疫保護率分別為25％（holA）、62.5％（GroEL）和75％(ykgC)。表明GroEL和yk