共表達GM-CSF和IL-2腺病毒載體的構(gòu)建及在人骨髓間充質(zhì)干細胞的表達.pdf

1、【背景】:樹突狀細胞瘤苗是目前最常用的腫瘤特異性T細胞免疫治療策略之一,而腫瘤原位活化樹突狀細胞是本領(lǐng)域一個重要的研究方向,如何將樹突狀細胞和T細胞活化因子運送至腫瘤局部是有待解決的難題之一。利用人骨髓間充質(zhì)干細胞具有腫瘤趨向性和低免疫原性的特性,將樹突狀細胞和T細胞活化因子導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細胞后運送至腫瘤局部表達可能是解決上述難題的方案之一。
　　【目的】:構(gòu)建共表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macr

2、ophage colony stimulating factor, GM-CSF)GM-CSF和白介素2(Interleukin-2, IL-2)的5型腺病毒載體(Ad5 GM-CSF-IL-2),感染人骨髓間充質(zhì)干細胞,檢測GM-CSF和IL-2的表達水平和持續(xù)時間,為體內(nèi)活化樹突狀細胞和T細胞提供實驗依據(jù)。
　　【方法】:實驗于2011-6/2012-12在解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院生物治療中心實驗室完成。用淋巴細胞分離液分離人外周

3、血單個核細胞后再用 RNA 提取試劑盒提取總RNA,以此為模板用RT-PCR方法擴增GM-CSF和IL-2基因cDNA,PCR擴增片段分別插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表達載體中,再利用腦心肌炎病毒內(nèi)部核酸進入位點(Internal ribosomal entry sites, IRES)序列,構(gòu)建腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2。采用AdMaxTM FLP重組腺病毒載體體系,將穿梭質(zhì)粒

4、pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2與pBGHfrtDE1,3 FLP骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細胞,通過重組酶位點特異性重組獲得Ad GM-CSF-IL-2。Ad GM-CSF-IL-2以100 pfu/細胞的感染復(fù)數(shù)感染常規(guī)培養(yǎng)至第三代的人骨髓間充質(zhì)干細胞,2h后,經(jīng) 10 Gy的g射線照射使其失去增值能力,分別用GM-CSF和IL-2 ELISA試劑盒在不同的時間點檢測細胞上清中GM-CSF和IL-2蛋白的水平。
　　

5、【結(jié)果】:經(jīng)測序證實,克隆獲得的GM-CSF、IL-2 cDNA 序列分別與GenBank NM_000758(435 bp)和GenBank NM_000586(462 bp)提供的序列完全一致。在腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC515的多克隆位點中,通過IRES序列將GM-CSF和IL-2串聯(lián)起來,構(gòu)成pDC515 GM-CSF-IL-2穿梭質(zhì)粒,脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM將上述穿梭質(zhì)粒與pBGHfrtDE1,3 FLP腺病

6、毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293包裝細胞,通過293細胞空斑形成,獲得Ad5 GM-CSF-IL-2毒種,凍融裂解后提取DNA,分別用GM-CSF和IL-2引物鑒定,可獲得兩條與GM-CSF和IL-2基因片段大小一致的片段；毒種反復(fù)擴增、CsCl純化獲得1010～1011pfu的病毒滴度。以感染復(fù)數(shù)為100 pfu/細胞的Ad5 GM-CSF-IL-2感染人骨髓間充質(zhì)干細胞,感染12 h即可在上清中檢測到兩種細胞因子的表達,至48-96 h表達