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文檔簡介
1、目的：（1）構(gòu)建人骨形態(tài)蛋白-2（Human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2）基因的重組腺病毒載體并鑒定；
（2）檢測hBMP-2基因轉(zhuǎn)染對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymAlstem cells，BMSCs）的影響。
方法：（1）以人cDNA為模板PCR擴(kuò)增hBMP-2基因，插入線性化的表達(dá)載體pAV-MCMV-EGFP-3FLAG
2、后，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子、陽性克隆測序無誤后，擴(kuò)增、抽提，將帶有目的基因的腺病毒表達(dá)載體和攜帶有腺病毒大部分基因的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝擴(kuò)增，PCR檢測目的基因、Western Blot檢測目的蛋白及終點(diǎn)稀釋法檢測病毒滴度；
（2）分離純化SD大鼠BMSCs并體外擴(kuò)增，通過腺病毒載體介導(dǎo)hBMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況、蛋白質(zhì)水平來測定轉(zhuǎn)
3、染后hBMP-2的表達(dá)、ALP定量測定鑒定成骨活性及MTT法評(píng)估hBMP-2對BMSCs的影響。
結(jié)果：(1)PCR獲得長度為1223bp的hBMP-2目的基因片段，同源重組表達(dá)載體經(jīng)陽性克隆PCR及測序鑒定，結(jié)果正確。
（2）293細(xì)胞內(nèi)包裝、擴(kuò)增，經(jīng)Western blot及PCR鑒定無誤后，獲得病毒滴度為5x1010pfu/ml的重組腺病毒。
（3）從SD大鼠骨髓提取物中分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)
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