基于菲律賓蛤仔的近海多環(huán)芳烴生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是持久性有機(jī)污染物(POPs)的一種，分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔?，多?shù)具有“三致”效應(yīng)，即致癌性、致畸性和致突變性，可通過(guò)生物累積及食物鏈傳遞給海洋生物，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來(lái)極大危害，目前已引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的極大重視。2011年歐盟委員會(huì)發(fā)布Regulation(EC) No835/2011法規(guī)提出以苯并(a)芘(BaP)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(β)熒蒽(BbF)和屈(Chr)4種多環(huán)芳烴

2、總含量作為食品中PAHs限量的新評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本論文選擇我國(guó)沿海重要經(jīng)濟(jì)貝類菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）為研究對(duì)象，利用數(shù)字基因表達(dá)譜和基因克隆表達(dá)分析研究了菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝的分子機(jī)制;研究了PAHs對(duì)菲律賓蛤仔不同組織累積含量、解毒代謝酶和相關(guān)基因以及損傷效應(yīng)的影響，初步探討了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)蓄積規(guī)律和毒性效應(yīng)，篩選基于菲律賓蛤仔的用于海洋PAHs污染評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物;并且通過(guò)對(duì)膠

3、州灣、萊州灣近海養(yǎng)殖水環(huán)境PAHs的含量分析以及基于菲律賓蛤仔的雙殼貝類PAHs生物監(jiān)測(cè)分析，驗(yàn)證了生物標(biāo)志物的有效性，也為評(píng)價(jià)PAHs對(duì)海洋生物毒性效應(yīng)、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境PAHs污染提供理論基礎(chǔ)。
　　1、菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝分子機(jī)制的研究
　　本章首先利用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)分析了BaP（1μg/L）脅迫15天時(shí)菲律賓蛤仔消化盲囊組織差異基因表達(dá)情況，對(duì)照組和染毒組分別獲得了1050

4、8312和11414297條clean reads，將clean reads上傳至NCBI SRA文庫(kù)(accession number:SRP034889);將clean reads與本實(shí)驗(yàn)室已完成拼接的菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)unigene進(jìn)行拼接比對(duì)，比對(duì)率分別為53.27％和52.22％;通過(guò)DGE序列比對(duì)分析，共篩得差異表達(dá)基因145條，其中上調(diào)基因58條，下調(diào)基因87條;經(jīng)GO功能聚類分析以及KEGG通路分析顯示，差異基因主要涉

5、及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、抗氧化代謝、細(xì)胞凋亡以及解毒代謝機(jī)制;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，選取5條差異表達(dá)關(guān)鍵基因（熱激蛋白22、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、Mantle gene6、皮連蛋白3、假定蛋白）以及8條非差異表達(dá)解毒代謝關(guān)鍵基因（芳烴受體、熱激蛋白90、熱激蛋白70、環(huán)氧化物水解酶、二氫二醇脫氫酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶）驗(yàn)證了DGE結(jié)果可靠性。
　　通過(guò)RACE和RT-PCR技術(shù)獲得菲律賓蛤仔

6、熱激蛋白70(HSP70)、熱激蛋白90(HSP90)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其中HSP70全長(zhǎng)2336 bp(GenBank Accession Number:KJ569079)，HSP90全長(zhǎng)2839 bp(GenBank Accession Number:KJ569080);序列分析表明HSP70基因含有51 bp的5'端非編碼區(qū)、335 bp的3'端非編碼區(qū)和1950 bp的開(kāi)放閱讀框，開(kāi)放閱讀框編碼650個(gè)氨基酸;HSP90基

7、因含有107bp的5'端非編碼區(qū)、554 bp的3'端非編碼區(qū)和2178 bp的開(kāi)放閱讀框，開(kāi)放閱讀框編碼726個(gè)氨基酸;同源性分析顯示2種基因的蛋白序列與其它雙殼貝類的HSP具有較高的同源性;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，兩者均與其它雙殼貝類親緣關(guān)系最近，與蝦蟹等節(jié)肢動(dòng)物次之，而與硬骨魚(yú)類和高等脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn);組織特異性分析發(fā)現(xiàn)HSP70與HSP90在菲律賓蛤仔消化盲囊、鰓、閉殼肌和外套膜中均有表達(dá)，兩者均在消化盲囊和鰓中表達(dá)量較高;并且

8、通過(guò)qRT-PCR技術(shù)初步研究了HSP70和HSP90在菲律賓蛤仔PAHs解毒代謝中的功能。
　　2、菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下生物標(biāo)志物篩選技術(shù)的研究
　　本章以菲律賓蛤仔為研究對(duì)象，將其暴露于PAHs(混合比例BaP∶ BbF∶ Chr∶ BaA=1∶1∶1∶1;染毒梯度:0、0.05、0.5、5μg/L)21d，分別于0、1、3、6、10、15、21d取樣，之后停止染毒，進(jìn)行PAHs消除實(shí)驗(yàn)，分別于22、24、27、3

9、1、36d取樣，取樣組織為鰓、消化盲囊、閉殼肌。測(cè)定了PAHs在4種組織中的累積含量，研究了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的蓄積特征與消除規(guī)律，結(jié)果表明，各處理組不同組織中PAHs的累積含量在染毒實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈逐漸升高趨勢(shì)，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量效應(yīng)，在同一染毒濃度下，相同組織中4種PAHs累積含量的順序基本為Chr＞BaA＞BaP＞BbF;不同組織中PAHs蓄積含量的順序基本為消化盲囊＞鰓＞軟體部＞閉殼肌。消除實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，PAHs的累積含量顯著下降，

10、基本在31d趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后中、高濃度PAHs處理組中PAHs累積含量仍然顯著高于對(duì)照組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組無(wú)顯著變化。
　　為了研究PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的毒性效應(yīng)，取染毒和消除實(shí)驗(yàn)中的鰓和消化盲囊組織，測(cè)定了以下幾種解毒代謝酶及相關(guān)基因(i)Ⅰ相解毒代謝酶(AHH、DD、EH)和Ⅱ相解毒代謝酶(GST、UGT、SULT);(ii)抗氧化防御酶相關(guān)指標(biāo)(總抗氧化能力、SOD、GSH/GSSG);(iii)生物大分子損傷

11、（DNA鏈斷裂、蛋白羰基化、脂質(zhì)過(guò)氧化）解毒代謝關(guān)鍵基因表達(dá)（PgP、AhR、HSP90、ARNT、EH、DD、GST、SULT、SOD）。結(jié)果表明，不同濃度處理組鰓和消化盲囊組織中所有指標(biāo)均被不同程度誘導(dǎo)，都具有明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)，其中消化盲囊組織比鰓變化明顯。依據(jù)PAHs累積含量與不同指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，選取相應(yīng)的指標(biāo)作為評(píng)價(jià)海洋PAHs污染的生物標(biāo)志物。
　　3、基于菲律賓蛤仔的膠州灣、萊州灣PAHs生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究<

12、br>　　膠州灣（紅島、營(yíng)海）、萊州灣（廣利港、下?tīng)I(yíng)港）近海不同季度現(xiàn)場(chǎng)取樣（3月、6月、9月、12月）結(jié)果表明，膠州灣營(yíng)海站點(diǎn)的表層海水與沉積物中PAHs污染較嚴(yán)重，而萊州灣廣利港的PAHs污染情況要比下?tīng)I(yíng)港嚴(yán)重;各站點(diǎn)中6月和9月的PAHs污染情況較嚴(yán)重;菲律賓蛤仔消化盲囊中AHH、GST和SOD酶活力、DNA堿解旋、HSP90、DD和GST的mRNA基因表達(dá)與PAHs含量具有較好的一致性，為篩選膠州灣、萊州灣PAHs污染監(jiān)測(cè)的有效