人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NP1重組桿狀病毒的制備及NP1核定位信號的初探.pdf

1、2005年，瑞典科學(xué)家Tobias Allander等利用隨機(jī)PCR、高通量測序和生物信息學(xué)的方法在下呼吸道被感染的嬰幼兒標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)一種新病毒，根據(jù)序列同源性將其命名為人類博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)。人類博卡病毒是一種二十面體對稱的細(xì)小病毒，直徑18-25nm，無囊膜，基因組以單鏈線性方式存在，大小約為5500bp。根據(jù)目前的分類系統(tǒng)，人類博卡病毒隸屬于博卡病毒屬，細(xì)小病毒亞科，細(xì)小病毒科。人類博卡病毒的基因組

2、主要有三個(gè)開放閱讀框，按5’到3’方向依次編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、非結(jié)構(gòu)蛋白NP1以及由重疊基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2。病毒感染細(xì)胞時(shí)，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1最先被轉(zhuǎn)錄和翻譯，病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)需要NS1蛋白的調(diào)控。另一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NP1作為博卡病毒屬特有的蛋白，功能還不明確，已有的研究表明其對犬細(xì)小病毒(MVC)的DNA復(fù)制具有重要作用。
　　 本課題根據(jù)人類博卡病毒基因組序列(NCBI GeneBank: GU139423

3、)設(shè)計(jì)多對引物擴(kuò)增NS1抗原表位（C端1423-2172 nt:750 bp）、NS1全長、NP1全長基因及NP1截短基因。NP1和NS1全長基因克隆到已成功插入人類博卡病毒啟動(dòng)子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供體質(zhì)粒上，將測序正確的pFB-BoV-EGFP、pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，72h后通過藍(lán)白斑篩選和酚氯仿抽提出正確的重組bacmid并轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞制備所需的重

4、組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1; NS1抗原表位基因插入原核表達(dá)載體pMal-c2x上， IPTG誘導(dǎo)及過柱純化MBP融合蛋白，最后免疫小鼠制備抗NS1蛋白的多克隆抗體;利用NetPhos2.0 Server軟件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所對應(yīng)的堿基，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增具磷酸化位點(diǎn)和無磷酸化位點(diǎn)的NP1截短基因，克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下

5、觀察綠色熒光的分布，初步探究NP1蛋白的核定位信號。同時(shí)，將NP1截短基因插入另一真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中，為探究NP1蛋白具體功能域做好克隆準(zhǔn)備。
　　 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組桿狀病毒、NS1抗體的制備為探究人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NP1的功能提供了豐富的科研材料;初步確定的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1在HeLa細(xì)胞中的核定位情況為以后進(jìn)一步研究此蛋白的相關(guān)功能提供了參考數(shù)