人和小鼠胚胎肺發(fā)育關(guān)鍵基因表達(dá)模式的比較研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物肺的發(fā)育起源于前腸腹側(cè)的內(nèi)胚層。肺原基形成后，上皮組織不斷生長，并反復(fù)分支形成各級(jí)氣管，支氣管至肺泡。哺乳動(dòng)物胎肺發(fā)育可以分為四個(gè)階段：假腺肺階段、微管肺階段、囊狀肺階段和泡狀肺階段。肺的發(fā)生涉及到許多復(fù)雜的分子機(jī)制。已有研究表明：Bmp、Fgf、Wnt、Shh等信號(hào)通路對(duì)小鼠胚胎肺分支形態(tài)發(fā)生及P-D軸形成至關(guān)重要。Fgf10在肺分支起始，于遠(yuǎn)端間充質(zhì)預(yù)定氣管形成區(qū)中表達(dá)，隨后擴(kuò)散，與位于上皮的受體Fgfr2b結(jié)合激活該信號(hào)通

2、路，誘導(dǎo)肺芽形成。Bmp4主要在上皮中表達(dá)，并在分支的末端表達(dá)最強(qiáng)。它通過局部抑制上皮的增殖，對(duì)Fgf10信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，阻止分支的延伸，從而導(dǎo)致新分支點(diǎn)的形成。肺上皮末梢的Shh信號(hào)既能抑制Fgf10的表達(dá)，又能激活Patched受體，從而通過Gli3、Foxf1積極調(diào)控Fgf10的表達(dá)。另外，Hhip被Shh誘導(dǎo)表達(dá)后會(huì)反過來抑制Shh信號(hào)而促進(jìn)Fgf10的表達(dá)。因此，在肺芽遠(yuǎn)端，高水平的Shh和Hhip就導(dǎo)致該區(qū)域較鄰近的間充質(zhì)有

3、更少的Shh信號(hào)，更多的Fgf10表達(dá)。而遠(yuǎn)離肺芽遠(yuǎn)端末梢處低水平的Shh信號(hào)則能誘導(dǎo)鄰近間充質(zhì)中更多Fgf10的表達(dá)，這就導(dǎo)致肺芽隨后新的側(cè)邊分支的產(chǎn)生。在肺芽分支過程中，上皮中的Wnt經(jīng)典通路會(huì)激活Fgfr 2b的表達(dá)，而間充質(zhì)中的Wnt信號(hào)(單獨(dú)作用或與上皮中的Wnt一起)則會(huì)抑制Fgf10的表達(dá)，這就保證了肺芽僅在特定位置出現(xiàn)。非經(jīng)典通路的Wnt信號(hào)分子Wnt5a在經(jīng)典Wnt信號(hào)作用之后(肺發(fā)育的中期，肺泡形成時(shí))，對(duì)遠(yuǎn)端的發(fā)育

4、起著決定性的作用。剔除Wnt5a，會(huì)導(dǎo)致胎肺上皮過度分支：過表達(dá)則表現(xiàn)為分支不足，遠(yuǎn)端氣道明顯膨大。目前關(guān)于這些因子在人胚胎肺發(fā)育過程中的表達(dá)調(diào)控作用和表達(dá)模式與小鼠是否接近未有報(bào)道。此外，已有報(bào)道說對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要的同源異型框基因Shox2在小鼠面額部、肢體、心臟以及骨骼的發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，SHOX2與人類胚胎發(fā)育過程中肢芽、鰓弓、鼻、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成有關(guān)，但關(guān)于該基因基因?qū)Σ溉閯?dòng)物胎肺發(fā)育的影響及在其信號(hào)傳

5、導(dǎo)通路中的作用還未見報(bào)道。 為研究人胚胎肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征，為深入研究人胚胎肺發(fā)育過程中各基因的表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制，并為人胚胎肺發(fā)育過程中相關(guān)疾病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)首先比較了人與小鼠胚胎肺發(fā)育早、中期的形態(tài)特征，接著檢測了人胚胎肺中相關(guān)基因的表達(dá)情況，并與同期鼠胚進(jìn)行比較。同時(shí)，本研究首次檢測了Shox2和SHOX2基因在小鼠和人胚胎肺中的表達(dá)，并以Shox2基因敲除小鼠為模型，研究了Shox2對(duì)胎肺發(fā)育的影響。論文主

6、要分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行。 第一部分，本實(shí)驗(yàn)利用組織學(xué)的研究方法，根據(jù)人胚胎肺來源的時(shí)期，取人胚假腺肺早、中、末期及微管肺中期的胎肺進(jìn)行組織學(xué)切片，觀察其形態(tài)變化特征，并與同期野生型小鼠胚胎肺結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。組織學(xué)結(jié)果顯示：在人胚假腺肺階段，肺呼吸樹開始發(fā)育，形成相互通連的氣管和各級(jí)支氣管，并在細(xì)支氣管木端再分支形成短管束；到了微管肺階段，分支的短管束伸長，并進(jìn)一步向外周分支、擴(kuò)展形成終末導(dǎo)管，肺泡開始發(fā)育，血管開始形成并整合入肺泡

7、上皮細(xì)胞之間。在與同期小鼠胚胎肺發(fā)育形態(tài)進(jìn)行比較后可以初步得出結(jié)論：人和小鼠在胚胎肺發(fā)育早、中期形態(tài)特征基本相似，這為后續(xù)以小鼠為模型研究人類肺部疾病提供了一定的依據(jù)。 第二部分，本研究利用RNA原位雜交技術(shù)及RT-PCR的方法檢測了關(guān)鍵基因在人胚胎肺發(fā)育各階段的表達(dá)模式。 首先，本實(shí)驗(yàn)檢測了在小鼠胚胎肺發(fā)育中起重要調(diào)控作用的4個(gè)基因BMP4FGF、 WNT、SHH在人胚胎肺早期和中期的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SHH在人胚胎肺發(fā)

8、育的假腺期早期和末期的肺上皮中均有較強(qiáng)烈表達(dá)，且沿P-D軸(proximal-distal axis，近—遠(yuǎn)端軸線)呈梯度表達(dá)，在上皮末梢表達(dá)最為強(qiáng)烈，至微管肺中期，已未見SHH的明顯表達(dá)；WNT5A在假腺肺早期的肺上皮末梢及間充質(zhì)中呈微弱表達(dá)，至假腺肺末期表達(dá)水平有所上升，到了微管肺中期，WNT5A開始呈現(xiàn)彌散狀表達(dá)，在近端支氣管及末端肺泡上皮細(xì)胞中均有較強(qiáng)烈表達(dá)；BMP4則在假腺肺早期、末期及微管肺中期均無明顯表達(dá)；FGF10在假腺

9、肺早期、末期及微管肺中期的肺上皮中呈微弱表達(dá)。與同期的小鼠胚胎肺比較后發(fā)現(xiàn)：SHH和WNT5A在人胚胎肺中的表達(dá)模式與小鼠基本一致，但BMP4和FGF10在人胚胎肺中的表達(dá)與小鼠存在顯著差異。 其次，本實(shí)驗(yàn)首次檢測了Shox2基因在小鼠胚胎肺中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示Shox2基因在小鼠胚胎假腺肺早、中期的肺上皮中均有明顯特異性表達(dá)，至假腺肺末期，Shox2基因的表達(dá)水平已有所下降，到了微管肺階段，Shox2基因已基本不表達(dá)。由此，

10、為了進(jìn)一步研究Shox2在小鼠胚胎肺發(fā)育中所起的作用，我們以小鼠為模型，利用已構(gòu)建好的Shox2基因敲除小鼠從組織形態(tài)學(xué)上初步研究了Shox2基因?qū)π∈笈咛シ伟l(fā)育的影響，通過與同期野生型鼠胚相比，來觀察Shox2基因敲除小鼠胚胎肺發(fā)育各階段的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：至E17.5時(shí)，Shox24-/-型小鼠胚胎肺發(fā)育的形態(tài)與同期C57BL/6野生型小鼠胚胎肺的形態(tài)出現(xiàn)重大差別。在E17.5微管期結(jié)束原始腫泡期開始時(shí)，突變體小鼠的胎肺發(fā)育未能發(fā)生終

11、末導(dǎo)管的擴(kuò)張、分隔形成以及肺泡細(xì)胞的分化等組織形態(tài)學(xué)上的變化，不能形成成熟肺泡，而是仍然處于細(xì)支氣管的分支過程，并且形成的分支數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于野生型小鼠。研究結(jié)果顯示Shox2基因在小鼠胚胎肺發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。基于Shox2基因在小鼠胚胎肺中的表達(dá)情況及其對(duì)于小鼠胚胎肺發(fā)育的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了SHOX2基因在人胚胎肺中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其與同期鼠胚胎肺中Shox2的表達(dá)模式極為相似。這

12、就說明SHOX2基因在人胚胎肺發(fā)育中所起的作用很可能與Shox2在鼠胚胎肺發(fā)育中所起的作用相似甚至相同，從而為以小鼠為模型研究人類肺部疾病奠定了基礎(chǔ)。 此外，鑒于BMP4和FGF10在人胚胎肺中的表達(dá)模式與小鼠存在差異，我們又利用RT-PCR的方法檢測了BMPs和FGFs家族其他成員的表達(dá)，結(jié)果顯示FGF7在假腺肺早期和微管肺早期均有較強(qiáng)表達(dá)：BMP3、BMP5、BMP7和FGF9在假腺肺早期有較強(qiáng)表達(dá)，到微管肺早期表達(dá)減弱：F

13、GF1于假腺肺早期有微弱表達(dá)，至微管腫早期已不表達(dá)：FGF2、FGF18在假腺肺早期和微管肺早期均未見其表達(dá)。由此我們初步推斷在人胚胎肺發(fā)育中BMPs和FGFs家族的其他成員可能代替或補(bǔ)償了BMP4和FGF10的功能，這有待于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。 本實(shí)驗(yàn)在比較人和小鼠胚胎肺發(fā)育形態(tài)差異的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)人和小鼠胚胎肺雖然存在形態(tài)發(fā)育上的相似性，但它們基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制還存著一定差異。同時(shí)推測在人胚胎肺發(fā)育過程中，RT-PC