玉米種子特異性表達(dá)基因Zpu1和brittle2啟動(dòng)子的分離與功能分析.pdf

1、基因工程在很大程度上是將目的基因以一定的表達(dá)量在特定的組織中表達(dá)，因而需要一些調(diào)控外源基因有效表達(dá)的分子元件，其中啟動(dòng)子是最重要的一個(gè)。隨著基因工程的不斷發(fā)展，為了滿足基因工程對(duì)不同功能啟動(dòng)子的需要，就必須分離一些新型有效的啟動(dòng)子，對(duì)它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、活性強(qiáng)弱以及時(shí)空表達(dá)特異性進(jìn)行深入的研究。玉米作為世界上最大的糧食和飼料作物，其基因工程的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有巨大的應(yīng)用前景。玉米種子中富含淀粉，但是有關(guān)淀粉合成途徑中一些重

2、要基因的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)和功能的研究相對(duì)比較少。因此，分離淀粉合成途徑中的重要基因的啟動(dòng)子并研究其表達(dá)特性，對(duì)于將玉米種子作為生物反應(yīng)器并在其中表達(dá)并儲(chǔ)藏有價(jià)值的蛋白是很有意義的。 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中Zpu1cDNA的序列(AF080567)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過RT-PCR方法從授粉后28天的玉米種子的總RNA中擴(kuò)增出一條674bp的片段。該片段位于Zpu1cDNA的5'端，用它作為探針篩選玉米lambda噬菌體基因組文庫(kù)。

3、經(jīng)過四輪的篩選得到了10個(gè)純化的陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切分析，最后選擇用EcoRI單酶切的一條約3.5kb的目的片段進(jìn)行亞克隆。將亞克隆片段構(gòu)建到測(cè)序載體上測(cè)序，結(jié)果表明該片段全長(zhǎng)3601bp，其中有2267bp為Zpu1基因的5'側(cè)翼序列，1334bp為Zpu1基因編碼區(qū)序列，在1334bp的基因編碼區(qū)序列中包含了四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。對(duì)2267bp的5'側(cè)翼序列進(jìn)行5'端和3'端的缺失，得到5條不同長(zhǎng)度的片段：分離到的全長(zhǎng)片段

4、Z1(2267bp，-2267～-1)；三條5'端缺失片段分別為Z2(1943bp，-1943～-1)，Z3(1153bp，-1153～-1)和Z4(516bp，-516～-1)；一條3'端缺失片段為Z5(1754bp，-2267～-513)。將這5個(gè)片段插入到真核表達(dá)載體pBI121中替換35S啟動(dòng)子，從而得到了5個(gè)植物表達(dá)載體：pZ1，pZ2，pZ3，pZ4和pZ5。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將這些載體轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)煙草再生植株進(jìn)行PCR檢

5、測(cè)，五個(gè)載體分別得到了不同數(shù)目的PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因煙草植株不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期對(duì)不同的組織和器官進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和熒光定量檢測(cè)。結(jié)果表明： (1)五個(gè)缺失載體的轉(zhuǎn)基因植株在幼苗時(shí)期的根、莖、葉和開花后兩天的柱頭和子房等組織中均沒有GUS活性，說明這五個(gè)片段在這些組織中都沒有啟動(dòng)活性； (2)Zpu1啟動(dòng)子的近端516bp的片段Z4能驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在種子中表達(dá)，并且表達(dá)模式與分離的全長(zhǎng)(2267bp)片

6、段Z1很相似，只是Z4的表達(dá)量比Z1低很多； (3)當(dāng)缺失Zpu1啟動(dòng)子遠(yuǎn)端的324bp的區(qū)域時(shí)，啟動(dòng)子的表達(dá)模式發(fā)生了很大的變化，由種子特異性表達(dá)變?yōu)榻M成型表達(dá)，此區(qū)域可能存在一個(gè)正調(diào)控元件，可以提高啟動(dòng)子在玉米種子中的表達(dá)； (4)在-1153至-516區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)負(fù)調(diào)控元件，可以抑制啟動(dòng)子在各個(gè)組織和器官中的表達(dá)； (5)比較5'端缺失的Z4片段和3'端缺失的Z5片段的表達(dá)活性，表明Zpu1基因5'側(cè)翼序