神經(jīng)肽Y引起人肝細胞調(diào)亡機制的比較蛋白組學研究.pdf

1、神經(jīng)肽Y(NeuropeptideY，NPY)是一種由36個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)類似于鳥胰多肽(avianpancreaticpolypeptide，APP)及多肽YY(peptideYY)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其豐富地表達于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。當交感神經(jīng)激活時，NPY可與去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)共同被交感神經(jīng)末梢所釋放。NPY通過六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的作用。在中樞，NPY可影響學習、記憶、攝食等功能

2、；而在外周，它對循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均產(chǎn)生影響。
　　 肝臟是人體最大的腺體，是新陳代謝的重要器官。肝臟被大量的傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)(交感和副交感神經(jīng))所支配。研究表明，在人類肝臟中，NPY能神經(jīng)元是人體肝臟中最為豐富的肽能神經(jīng)元。NPY能神經(jīng)元大量分布于肝動脈、門靜脈以及膽道周圍，并且直接貫穿于肝小葉，與肝細胞直接接觸，從而形成一個復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。有研究報道交感神經(jīng)能夠通過末梢釋放NPY和NE調(diào)節(jié)肝血管的血液量，而NPY

3、對肝細胞的作用卻鮮有報道。
　　 基于納升級二維液相－串聯(lián)質(zhì)譜(2D-nano－LC－MS/MS)的鳥槍法蛋白組學研究技術(shù)是指將目標蛋白組進行酶解形成混合肽段后，采用納升級二維液相色譜對肽段混合物進行分離，接著通過串聯(lián)質(zhì)譜逐一檢測特征性肽段，所得數(shù)據(jù)運用SEQUEST等軟件進行數(shù)據(jù)分析，從而高通量、高靈敏度和高精度地對蛋白質(zhì)進行鑒定。
　　 為研究NPY對肝細胞的作用及其分子機制，我們以人肝細胞L-02為研究對象，進行了

4、以下工作：
　　 1、采用MTT法測定不同濃度的NPY對人肝細胞L-02活力的影響。
　　 2、應(yīng)用Westernblot檢測NPY刺激人肝細胞L-02后凋亡標志性蛋白的變化。
　　 3、應(yīng)用基于納升級二維液相－串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學技術(shù)研究人肝細胞L-02在經(jīng)過NPY刺激后，其蛋白表達譜的變化，從中挖掘NPY引起人肝細胞凋亡的信號通路。
　　 4、應(yīng)用生物信息學軟件分析蛋白組數(shù)據(jù)，同時查閱文獻，篩選與

5、凋亡密切相關(guān)的蛋白。發(fā)掘NPY引起人肝細胞凋亡的可能信號通路，并應(yīng)用Westernblot對部分蛋白的表達變化進行驗證。
　　 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素，進一步觀察mTOR信號通路在NPY引起人肝細胞凋亡中的作用。
　　 主要工作結(jié)果如下：
　　 1、NPY可呈劑量依賴性明顯降低人肝細胞L-02的活力，且1nMNPY即具有顯著作用。
　　 2、NPY可導致L-02細胞凋亡標志性蛋白表達發(fā)生明顯變化

6、，L-02細胞在經(jīng)過NPY的刺激后，其剪切caspase-3表達上調(diào)，Bcl-2家族中Bax、Bad表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)。結(jié)果顯示，NPY可引起L-02細胞的凋亡。
　　 3、應(yīng)用基于納升級二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學研究技術(shù)，10nM的NPY刺激L-02細胞后，有317個蛋白的表達呈現(xiàn)差異，其中80個蛋白表達上調(diào)，237個蛋白表達下調(diào)。經(jīng)過查閱篩選，與凋亡密切相關(guān)的蛋白有12個，我們關(guān)注其中的4個蛋白，即哺乳動物

7、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，細胞色素c(cytochromec)，核糖體蛋白S6激酶(S6K)和熱休克蛋白70(Hsp70)。mTOR可通過激活S6K而磷酸化BAD，Hsp70可通過JNK來調(diào)節(jié)cytochromec的釋放，而cytochromec則能夠活化caspase-9從而剪切caspase-3，引起細胞的凋亡。
　　 4、經(jīng)Westernblot的進一步驗證，mTOR、cytochromec、S6K和Hsp70的表達與納

8、升級二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜所檢測的表達模式一致，mTOR、S6K、cytochromec表達上調(diào)，Hsp70表達下調(diào)。
　　 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素后，NPY引起L-02細胞的凋亡被逆轉(zhuǎn)。
　　 綜上所述，NPY可呈劑量依賴地促進人肝細胞的凋亡。10nMNPY刺激L-02細胞24h后，12個與凋亡相關(guān)的蛋白發(fā)生變化，其中4個具有密切的聯(lián)系，我們進一步推測mTOR/S6K/BAD、Hsp70/cytochromec/