熊果酸誘導(dǎo)TC-1癌細(xì)胞自噬性死亡中線粒體相關(guān)機(jī)制的探討.pdf

1、研究背景：
　　線粒體是一種普遍存在于大多數(shù)真核細(xì)胞的動態(tài)細(xì)胞器，其形態(tài)、大小、數(shù)量和分布隨著代謝條件的不同發(fā)生變化，具有多形性、運(yùn)動性、易變性、和適應(yīng)性等特點，其主要作用是通過氧化磷酸化產(chǎn)生直接能源物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP），享有“能量工廠”的美稱。大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞在線粒體氧化磷酸化途徑供給ATP不足的情況下，往往更多依賴糖酵解提供能量來滿足其快速生長的需要。但是與線粒體有氧代謝相比，糖酵解代謝是非常低效率的產(chǎn)能過程。氧化磷酸化

2、過程發(fā)生在線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈上，電子傳遞鏈由一系列能可逆的接收和釋放電子或氫質(zhì)子的脂蛋白復(fù)合物組成，主要由四個大型跨膜蛋白復(fù)合體組成，分別是線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I、II、III和IV。線粒體也可以通過電子傳遞鏈產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧（ROS），腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平往往比正常細(xì)胞高。另外，線粒體還涉及腫瘤細(xì)胞的凋亡與自噬過程。
　　自噬是一種程序性死亡機(jī)制，根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬

3、三種。一般情況下自噬所說的是大自噬，指細(xì)胞內(nèi)長壽蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器被雙層膜包裹，并運(yùn)送到溶酶體降解和再利用的過程。自噬廣泛存在于機(jī)體病理生理過程中，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管及肺部等疾病都和自噬有密切聯(lián)系。近年大量研究表明線粒體功能與細(xì)胞自噬有關(guān)聯(lián)，已被證實線粒體功能與自噬體的形成和成熟相關(guān)，當(dāng)線粒體功能障礙時，自噬體參與損傷線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的質(zhì)量，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　熊果酸（Ursolic acid，UA

4、）廣泛存在于天然植物和中草藥中。具有許多重要的生物效應(yīng)，如抗腫瘤，抗炎，保肝和降血脂等，而且低毒。我們課題組最近發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬相關(guān)性死亡，從而發(fā)現(xiàn)熊果酸抗腫瘤的新機(jī)制。但是在熊果酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)性死亡中，線粒體的作用還不清楚。實驗?zāi)康谋緦嶒炛荚谔接懢€粒體在熊果酸誘導(dǎo) TC-1癌細(xì)胞自噬相關(guān)性死亡中的作用。
　　方法：
　　利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，熊果酸實驗濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM，

5、作用TC-1細(xì)胞24小時后，普通光鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化；各種濃度熊果酸分別作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法檢測熊果酸對TC-1癌細(xì)胞增殖抑制作用；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜跨電位及細(xì)胞內(nèi)ATP和ROS水平變化；分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1細(xì)胞6小時后，在透射電鏡下檢測線粒體形態(tài)變化；熒光顯微鏡下觀察線粒體與自噬標(biāo)志蛋白LC3的位置關(guān)系。
　　結(jié)果：

6、　　光鏡下可見熊果酸作用24小時，10μM濃度組的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變，而20μM或30μM組的細(xì)胞變圓，貼壁松散，分布稀疏，及細(xì)胞兩極出現(xiàn)黑色小點，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞死亡；MTT實驗結(jié)果顯示熊果酸對TC-1癌細(xì)胞有顯著的增值抑制作用，并呈時間、劑量依賴，尤其是作用3天后，各組抑制率均達(dá)90％以上（P＜0．05)；當(dāng)熊果酸作用24小時，陰性象限熒光占總熒光的比例分別為3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，陰性象限比例越大線粒體膜跨電

7、位(Δψm)越低，表明Δψm隨著熊果酸作用濃度升高而降低，UA30μM組Δψm降低尤其顯著（P＜0．05)；線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV的活性經(jīng)熊果酸作用24小時均出現(xiàn)明顯抑制，尤其是復(fù)合酶IV（P＜0．05)；經(jīng)熊果酸作用24小時，10μM組即出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著降低；熊果酸30μM分別作用0、4、8、12、24小時，細(xì)胞內(nèi)ATP水平隨作用時間延長逐漸降低，呈時間依賴，并且作用4小時，與對照比ATP水平降低超過50%，

8、12小時后，ATP水平接近0 nmol/mg/protein（P＜0．05)；細(xì)胞內(nèi)ROS的水平也隨熊果酸作用濃度升高而顯著降低，熊果酸作用24小時細(xì)胞內(nèi)ROS陽性率分別是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05)。另外，利用電鏡與熒光顯微鏡檢測線粒體自噬是否存在時，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)熊果酸30μM作用6小時，出現(xiàn)線粒體腫脹、嵴斷裂及線粒體碎屑，并在胞漿中散在分布大量的雙層膜結(jié)構(gòu)且包裹損傷的細(xì)胞器，在損傷的線粒體